Pesticides et effets sur la santé
IV. Focus sur des substances actives

2021

20-

Fongicides inhibiteurs
de la succinate déshydrogénase

Préambule

Cette alerte a conduit à une autosaisine de l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (Anses) dont l’objectif était de déterminer s’il y avait une alerte sanitaire au regard des données scientifiques disponibles. Le résultat de cette expertise, sur la base des données issues de la littérature scientifique, des évaluations européennes des substances et de la phytopharmacovigilance, concluait à l’absence « d’éléments en faveur de l’existence d’une alerte sanitaire qui conduirait au retrait des autorisations de mise sur le marché » des fongicides SDHi (Anses, 2019).

Introduction

De par leur usage, les pesticides peuvent constituer une source de contamination environnementale de l’air, de l’eau et des sols, et par conséquent des faunes et des flores associées. Ces contaminations environnementales engendrent une exposition humaine qui varie aussi selon les propriétés chimiques des molécules et leurs modes d’absorption. L’évolution de l’agriculture en France (spécialisation des exploitations, mécanisation, recherche et développement...) a conduit à une augmentation de leur usage et, par conséquent, de la contamination de ces compartiments environnementaux, avec parfois une rémanence de nombreuses années après l’arrêt de leur utilisation en raison de la faible dégradation biotique ou abiotique de certaines molécules (Aubertot et coll., 2005).

Les inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (succinate dehydrogenase inhibitors, SDHi), qui font l’objet de ce chapitre, sont des fongicides utilisés pour lutter contre la prolifération de moisissures dans les productions agricoles. Les moisissures ont des effets néfastes sur la santé humaine et animale : elles sont responsables d’infections (généralement de type opportuniste) et peuvent provoquer des allergies, des irritations, et des symptômes respiratoires. Certaines synthétisent des métabolites (par exemple, aflatoxines, ochratoxines...) ayant des effets hépatotoxiques (notamment cancérogènes), immunotoxiques, néphrotoxiques ou neurotoxiques, en particulier dans le cas d’ingestion à long terme (Afssa, 2009). La contamination par les moisissures des cultures, des fruits et des légumes est un enjeu de santé publique (Lee et Ryu, 2017), particulièrement dans un contexte de réchauffement climatique de nature à favoriser leur développement (Battilani et coll., 2016). L’usage des fongicides est croissant et tend à s’élargir, d’autant que l’on découvre que certains possèdent, en plus de leurs propriétés antifongiques, des propriétés insecticides et antiparasitaires (Sakai et coll., 2012 ; Inaoka et coll., 2015 ; Ren et coll., 2018). L’usage important des fongicides a conduit au développement de champignons résistants, nécessitant une utilisation encore accrue, la production de nouvelles molécules ou l’association de plusieurs fongicides pour le traitement des cultures et produits de l’agriculture (Lucas et coll., 2015).

La succinate déshydrogénase : enzyme clé de la chaîne respiratoire

Complexe II de la chaîne respiratoire

Les succinate-ubiquinone oxydoréductases (SQR) sont regroupées dans 5 classes (A à E) d’après le nombre de sous-unités hydrophobes et de groupements héminiques (Lemos et coll., 2002). La SQR mitochondriale (complexe II) appartient à la classe C avec un groupe hème et deux sous-unités transmembranaires. Le complexe II, localisé dans la membrane interne de la mitochondrie, participe à deux processus métaboliques interconnectés assurant la production d’énergie : la respiration cellulaire où elle permet le transfert d’électrons vers l’ubiquinone ou coenzyme Q, et le cycle de Krebs où elle catalyse l’oxydation du succinate en fumarate. Le complexe II est composé de quatre sous-unités protéiques SDHA, B, C, D et de quatre cofacteurs d’assemblage SDHAF1, SDHAF2, SDHAF3 et SDHAF4 tous exclusivement codés par le génome nucléaire (Ackrell, 2000 ; Moosavi et coll., 2019). Les facteurs d’assemblage SDHAF2 et SDHAF4 facilitent la maturation de la sous-unité SDHA, alors que les facteurs SDHAF1 et SDHAF3 participent à la réaction d’insertion du centre fer-soufre dans la sous-unité SDHB. Les sous-unités SDHA et B sont localisées dans le compartiment matriciel de la mitochondrie (figure 20.1). La SDHA humaine est une flavoprotéine de 72 kDa (664 acides aminés ; aa) comportant un groupe prosthétique flavine adénine dinucléotide (FAD) fixé par liaison covalente. La SDHB est une protéine fer-soufre de 32 kDa (280 aa) qui comporte trois centres fer-soufre ([2Fe-2S]^2+/1+, [4Fe-4S]^2+/1+ et [3Fe-4S]^2+/0). Les sous-unités SDHC et SDHD sont des protéines de respectivement 19 kDa (169 aa) et 17 kDa (159 aa), qui possèdent un groupement hème enchâssé entre leurs hélices transmembranaires. Intégrées à la membrane interne mitochondriale, elles ancrent les sous-unités A et B dans la membrane, conférant à la SDH une structure tétramérique. Concernant les aspects mécanistiques du fonctionnement de la SQR mitochondriale (complexe II), le succinate est oxydé en fumarate par la SDHA, ce qui s’accompagne de la réduction du FAD en FADH₂. Puis le FADH₂ transfère les électrons aux centres fer-soufre de la SDHB et le coenzyme Q est à son tour réduit. Les inhibiteurs spécifiques d’activité du complexe II se lient au site de liaison soit du succinate (SDHA), soit de l’ubiquinone (dénommé Q-site). Les composés agissant comme inhibiteurs compétitifs en se liant au Q-site ont été utilisés pour des études structurales du complexe II tels que le thénoyltrifluoroacétone (TTFA), et l’atpenin (Miyadera et coll., 2003 ; Sun et coll., 2005), groupe dans lequel se trouvent les fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase.

Chez l’être humain, quatre gènes codent les quatre sous-unités du complexe II : SDHA (15 exons, chromosome 5p15), SDHB (8 exons, chromosome 1p35), SDHC (6 exons, chromosome 1q23) et SDHD (4 exons, chromosome 11q23). Les sites de reconnaissance pour les facteurs de transcription NRF-1, NRF-2 et Sp1, sont communs à la plupart des promoteurs des gènes nucléaires codant les composants de la chaîne respiratoire, ainsi qu’à certaines des enzymes anti-oxydantes, plusieurs des enzymes biosynthétiques hémiques et certains composants de l’appareil mitochondrial. Bien que les sites de liaison à NRF-1 se trouvent dans la région promotrice des quatre gènes SDH, les sites de liaison de NRF-2 et de Sp1 ne sont pas présents dans les promoteurs SDHA et SDHC, respectivement. Les promoteurs des gènes SDHA et SDHB possèdent également des éléments de réponse au fer (IRE ou « Iron Responsive Element ») dans leur région promotrice, ce qui suggère leur implication potentielle dans l’homéostasie du fer cellulaire et/ou mitochondrial (Brière et coll., 2005).

Figure 20.1 Schéma récapitulant la structure et le fonctionnement de la succinate-ubiquinone oxydoréductase (SQR) mitochondriale (complexe II) (d’après Lemarie et Grimm, 2011)

Figure 20.1

Figure 20.1 Schéma récapitulant la structure et le fonctionnement de la succinate-ubiquinone oxydoréductase (SQR) mitochondriale (complexe II) (d’après Lemarie et Grimm, 2011)

Les sous-unités SDHA et SDHB catalysent l’oxydation du succinate en fumarate (une réaction faisant partie du cycle de Krebs ou tricarboxylic acid cycle ; TCA). Les électrons récupérés sont transférés au cofacteur FAD (associé à SDHA) puis aux centres fer-soufre (Fe-S, associé à SDHB), et conduisent à la réduction de l’ubiquinone (coenzyme Q ; CoQ) en ubiquinol (QH2) par l’activité succinate CoQ réductase (SQR).
(Figure traduite de l’anglais)

Pathologies liées à des mutations dans des gènes codant pour la succinate déshydrogénase

Chez l’être humain, le déficit héréditaire dans l’une des sous-unités de la SDH dont les premiers cas ont été décrits dans les années 1990, est une cause de maladie mitochondriale, avec de façon fréquente des atteintes neuro-logiques de l’enfant. Il est également rapporté des cas de cardiopathies (Courage et coll., 2017), de leucodystrophies (Alston et coll., 2012), d’encéphalopathies (Ma et coll., 2014), ainsi que des cancers (Baysal et coll., 2000 ; Habano et coll., 2003 ; Neumann et coll., 2004 ; Malinoc et coll., 2012 ; Dwight et coll., 2013b ; Dwight et coll., 2013a ; Killian et coll., 2013 ; Letouzé et coll., 2013 ; Ni et coll., 2015 ; Bausch et coll., 2017 ; Calió et coll., 2017 ; Lussey-Lepoutre et coll., 2017) (tableau 20.I).

Tableau 20.I Maladies associées aux mutations dans les gènes codant les sous-unités de la SDH (d’après Bénit et coll., 2018)

Chez les patients présentant une mutation constitutionnelle hétérozygote sur l’un des gènes codant une sous-unité de la SDH (dans toutes les cellules de leur organisme) et porteurs d’une tumeur, l’inactivation complète de la SDH (dans la cellule cancéreuse) peut se produire suite à une perte d’hétérozygotie, le plus souvent liée à la perte de la région chromosomique incluant l’allèle sauvage (Gimenez-Roqueplo et coll., 2003 ; Burnichon et coll., 2010). Ces deux évènements génétiques sont responsables d’une perte de l’activité SDH, conduisant à une accumulation massive de succinate (Pollard et coll., 2005).

Longtemps essentiellement associées à des maladies neurologiques (encéphalopathies, leucodystrophies) (Parfait et coll., 2000 ; Alston et coll., 2012 ; Ohlenbusch et coll., 2012) et des cardiomyopathies (Levitas et coll., 2010), les mutations des gènes SDHx (SDHA, SDHB, SDHC, ou SDHD) ont été identifiées dans des formes familiales de phéochromocytomes (PCC) et paragangliomes (PGL) au début des années 2000 (Baysal et coll., 2000 ; Neumann et coll., 2004). Les PCC et PGL sont des tumeurs rares, dérivées des cellules chromaffines, qui se développent dans les glandes médullo-surrénales et dans les ganglions des systèmes nerveux parasympathique et sympathique au niveau de la tête, du cou et du pelvis (Gimenez-Roqueplo, 2006). Comparés aux autres cancers, les PCC et les PGL sont caractérisés par un déterminisme génétique très particulier. À ce jour, plus de 15 gènes de susceptibilité ont été identifiés incluant 2 oncogènes (RET et HIF2A) et des gènes suppresseurs de tumeur (NF1, VHL, SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, SDHAF2, FH, TMEM127, MAX, MDH2, SLC25A11, GOT2, DNMT3A). Plus de 40 % des patients porteurs d’un PGL ou un PCC possèdent une mutation germinale sur l’un de ces gènes (Dahia, 2014). De plus, les mutations constitutionnelles affectant les gènes codant la SDHB ou la fumarate hydratase sont associées à un risque augmenté de métastases (Gimenez-Roqueplo et coll., 2003 ; Amar et coll., 2007 ; Castro-Vega et coll., 2014). Les gènes codant les sous-unités SDHB, SDHC et SDHD sont les gènes majeurs de susceptibilité des PGL et PCC. Sur une cohorte de 1 832 patients référencés avec un dépistage génétique en raison d’une histoire familiale de PGL ou PCC, 876 d’entre eux présentaient une mutation dans les gènes SDHB, SDHC et SDHD pour 673, 43 et 160 cas, respectivement (Andrews et coll., 2018). Parmi les 876 mutations, il est observé une minorité de délétions ou de duplications et une majorité de mutations ponctuelles intragéniques dont 44 % de faux-sens. Il est à noter que la pénétrance des mutations dans le gène SDHB est incomplète. Par ailleurs, des mutations « perte de fonction » dans les gènes codant NF1 ou VHL, ainsi que des mutations activant les oncogènes RET, HIF2A ou HRAS ont été décrites au niveau somatique dans environ 30 % de ces tumeurs (Burnichon et coll., 2012 ; Favier et coll., 2012 ; Crona et coll., 2013 ; Oudijk et coll., 2014).

D’autres types de tumeurs impliquant des mutations SDHx ont été décrites, incluant des tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) (Miettinen et Lasota, 2014), des tumeurs rénales, des tumeurs thyroïdiennes, des mélanomes, des sarcomes, des tumeurs coliques, des neuroblastomes (Dubard Gault et coll., 2018 ; Gill, 2018), des tumeurs neuroendocrines pancréatiques, des ganglioneuromes et des triades de Carney (Bezawork-Geleta et coll., 2017).

Dans la pathologie cancéreuse, les déficits en SDH ne sont pas uniquement liés à l’inactivation d’une sous-unité de l’enzyme par mutation. Il est ainsi rapporté quelques cas de déficits en SDH chez des patients présentant une GIST ou un PGL sans aucune mutation dans les gènes SDHx mais impliquant une régulation négative du niveau d’expression de l’ARNm codant la SDHC via une hyperméthylation de l’ADN affectant le promoteur de ce gène dans la tumeur, mais pas dans les tissus sains (Urbini et coll., 2015 ; Casey et coll., 2019). La diminution du niveau d’ARNm peut également être liée à l’augmentation d’expression de microARN (miARN) ciblant les ARNm codant les différentes sous-unités de la SDH, notamment miR-210 (SDHD), miR-31 (SDHA) et miR-378 (SDHB) (Eichner et coll., 2010 ; Puisségur et coll., 2011 ; Kelly et coll., 2013 ; Tsang et coll., 2014 ; Lee et coll., 2016 ; Merlo et coll., 2017).

Enfin, dans le but de générer des modèles animaux de PGL et PCC, plusieurs groupes ont utilisé une approche d’invalidation génique pour inactiver les gènes codant les sous-unités de la SDH chez les souris (Piruat et Millán-Uclés, 2014 ; Lepoutre-Lussey et coll., 2016) ou les rats (Siebers et coll., 2018 ; Powers et coll., 2020). À ce jour, les résultats de ces études montrent que les animaux porteurs d’une mutation hétérozygote ne présentent aucune prédisposition au cancer comparable à celle décrite chez l’être humain.

Les fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHi)

Les fongicides SDHi sont des agents à large spectre utilisés pour lutter contre les basidiomycètes, adélomycètes et ascomycètes. Ils sont représentés par une vingtaine de molécules partageant un même mécanisme d’action plutôt qu’une même structure. Néanmoins, ces fongicides SDHi sont tous des dérivés de structure amide (R1-CO-HN-R2) avec un groupement acide (R1) et un groupement amine (R2). Sept classes peuvent être définies sur la base de leur structure chimique et du groupement acide de la molécule : les benzamides (fluopyram, flutolanil), les furane carboxamides (fenfurame), les oxathiine carboxamides (carboxine, oxycarboxine), les pyrazole carboxamides (bixafène, penthiopyrade...), pyridine carboxamides (boscalide), thiazole carboxamides (thifluzamide) et pyrazine carboxamides (pyraziflumid). Les benzamides peuvent être subdivisés en deux sous-groupes sur la base du groupement amine : phényle benzamides (flutolanil) et pyridinyl éthylbenzamides (fluopyram). Les structures de quelques substances actives représentatives sont illustrées dans la figure 20.2.

Utilisation des SDHi en France

Le FRAC recense 23 substances actives SDHi (FRAC, 2020). Parmi elles, 12 sont autorisées en France en octobre 2020 avec des utilisations en traitement des parties aériennes, des semences, des sols ou des plants/tubercules (tableau 20.II). À noter que deux substances actives, la carboxine et le penflufène, sont autorisées sans que des spécialités commerciales les contenant ne soient autorisés en France ; au total, 42 formulations commerciales contenant de la carboxine et précédemment autorisées en France (premiers usages à la fin des années 1960) ont été retirées en 20184

D’après la base de données E-Phy de l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (Anses) disponible à l’adresse : https://ephy.anses.fr/ [consulté le 11 mai 2020].

. Les produits correspondants ne sont plus distribués depuis mi-2019 et ne doivent plus être utilisés depuis fin janvier 2020. L’autorisation de quatre substances actives SDHi, le bénodanil, le fenfurame, le mépronil et l’oxycarboxine, a été retirée par le règlement (CE) n^o 2076/2002 de la Commission du 20 novembre 20025

Cette information est donnée pour chacune de ces substances actives dans le EU Pesticide Database, disponible à l’adresse https://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database [consulté le 11 mai 2020].

(tableau 20.III). Le bénodanil a été autorisé sur les cultures ornementales entre 1983 et 1987. Le fenfurame a été autorisé pour la protection des plaies de taille et le traitement des semences entre 1983 et 1997. Le mépronil a été autorisé pour le traitement des sols, le traitement des semences et les cultures légumières entre 1986 et 2003 et l’oxycarboxine a été autorisée sur les cultures ornementales entre 1973 et 20026

Les informations sur l’usage de bénodanil, fenfurame, mépronil et d’oxycarboxine proviennent de la base CIPA (Compilation des index phytosanitaires ACTA), un outil du programme Matphyto disponible à l’adresse http://matphyto.acta-informatique.fr/ [consulté le 1^er avril 2020].

. Il existe neuf substances actives appartenant à la famille des SDHi non autorisées au niveau européen mais autorisées dans d’autres pays (voir addenda en fin de chapitre : tableau A20.I). Parmi ces substances actives, quatre sont en cours d’examen dans le processus d’autorisation de mise sur le marché au niveau européen : le pydiflumétofène, l’isoflucyprame, l’inpyrfluxame et le fluindapyr7

L’avancée des procédures d’autorisation de mise sur le marché peut notamment être suivie au travers de l’agenda et des résumés des réunions du Comité permanent des végétaux, des animaux, des denrées alimentaires et de l’alimentation animale, section produits phytopharmaceutiques, à l’adresse
https://ec.europa.eu/food/horizontal-topics/committees/appeal-committees/phytopharmaceuticals_en
[consulté le 1^er avril 2020]. Ainsi, les résumés des réunions du 11-12 juillet 2016, du 19-20 juillet 2018, du 20-21 mai 2019 et du 16-17 juillet 2019 font respectivement part de l’admissibilité des dossiers du pydiflumétofène, de l’isoflucypram, de l’inpyrfluxame et du fluindapyr. Le pydiflumétofène, pour lequel la procédure est la plus avancée, était récemment à l’agenda des réunions du 21-22 octobre 2019 et du 5-6 décembre 2019 suite à l’avis rendu par l’Efsa en septembre 2019 (Efsa, 2019).

. Deux substances actives SDHi, le furametpyr et le thifluzamide, ont fait l’objet d’une demande d’enregistrement préalable auprès de l’Agence européenne des produits chimiques (European Chemicals Agency ; Echa) au titre de la directive REACH8

Le furametpyr et le thifluzamide ont été préenregistrés le 31/05/2018 (https://echa.europa.eu/fr/information-on-chemicals/pre-registered-substances) [consulté le 1^er avril 2020].

. Elles ne sont pas autorisées pour une utilisation en tant que produit phytopharmaceutique. Enfin, aucun renseignement n’est disponible au niveau européen sur le pyraziflumid, qui a été homologué en mars 2018 par le Japon et dont l’examen par la réunion conjointe FAO/OMS sur les résidus de pesticides était prévu en 20209

http://www.fao.org/fileadmin/templates/agphome/documents/Pests_Pesticides/JMPR/2020_Call_for_data_Final.pdf
[consulté le 10 juin 2020].

.

Selon les données de la Banque nationale des ventes de distributeurs, les ventes de SDHi en France se situent entre 500 et 700 tonnes de substance active par an depuis 200810

https://www.data.gouv.fr/en/datasets/ventes-de-pesticides-par-departement/ [consulté le 10 juin 2020].

. Le boscalide, qui représentait près de 600 tonnes en 2009 (Anses, 2019), reste le plus vendu en 2018 avec 230 tonnes, sa part ayant progressivement diminué au profit d’autres SDHi, notamment le fluopyram, le fluxapyroxade, et le bixafène, avec respectivement 185, 161 et 97 tonnes de substance active vendues en 2018.

Figure 20.2 Illustration des structures chimiques représentatives des principaux SDHi

Figure 20.2

Figure 20.2 Illustration des structures chimiques représentatives des principaux SDHi

Toutes ces molécules sont des dérivés de structure amide (R1-CO-HN-R2).

D’après les données des enquêtes « Pratiques culturales » réalisées par le ministère français de l’Agriculture et de l’Alimentation11

http://sg-proxy02.maaf.ate.info/enquetes/pratiques-culturales/ [consulté le 2 septembre 2020].

(qui donnent des informations sur les utilisations de substances actives hors traitements de semence), les SDHi sont utilisés sur des cultures diverses. Ainsi, pour les années enquêtées, le boscalide est appliqué au moins une fois sur environ 80 % des surfaces de colza (données 2014), 51 % des surfaces de carottes (données 2013), 30 % des surfaces de fraises, salades (données 2013) et pommes (données 2012), 20 % des surfaces de vigne (données 2014) (11 % en 2011), melons et poireaux (données 2013), et 10 % des surfaces de blé tendre et orge (données 2014) (30 % en 2011). Le fluxapyroxade est associé à 38 % des surfaces en blé tendre traitées avec le moins une fois en 2014 et 24 % des surfaces en orge la même année. Le bixafène est associé à 38 % des surfaces en orge traitées au moins une fois en 2014 et 22 % des surfaces en blé tendre la même année. Ces données (obtenues sur un échantillon de parcelles agricoles) ne montrent pas de surfaces traitées avec le fluopyram (surtout vendu après 2014, date de la dernière enquête qui était disponible début 2019), le sédaxane, le benzovindiflupyr ou le penthiopyrade (Anses, 2019).

Parmi les 149 spécialités commerciales autorisées en France12

Autorisations en vigueur le 10 juin 2020, d’après le site : https://ephy.anses.fr

contenant une substance active SDHi, la plupart le sont au titre de leur seule fonction fongicide. Deux spécialités commerciales contenant le fluopyram comme unique substance active sont autorisées également pour leur fonction nématicide13

Il s’agit du Velum Prime (https://ephy.anses.fr/ppp/velum-prime) et du Vecalitepi (https://ephy.anses.fr/ppp/vecalitepi) [consulté le 2 septembre 2020].

. Quatre spécialités contenant du boscalide en association avec la pyraclostrobine (famille des strobilurines), sont autorisées à la fois pour leur fonction fongicide et pour leur fonction de régulateur de croissance14

Il s’agit de l’Astrial DG (https://ephy.anses.fr/ppp/astrial-dg), du Varium (https://ephy.anses.fr/ppp/varium), du Stelair (https://ephy.anses.fr/ppp/stelair) et du Racazeliu
https://ephy.anses.fr/ppp/racazeliu [consulté le 2 septembre 2020].

. La littérature scientifique récente montre que le complexe SDH représente une cible pour la sélection de nouveaux insecticides (Ren et coll., 2018), et nématicides utilisés en médecine vétérinaire (Sakai et coll., 2012 ; Inaoka et coll., 2015). En effet, la résistance aux nématicides a abouti à des résistances, voire des multi-résistances, chez les animaux et donc la recherche de nouveaux principes actifs ciblant le complexe SDH a été entreprise (Inaoka et coll., 2015 ; Myung et Klittich, 2015 ; Mathew et coll., 2016). En médecine humaine, un fongicide SDHi (ME1111) pour le traitement de la mycose des ongles a été proposé (Takahata et coll., 2016), ainsi qu’un médicament à activité anti-tumorale (lonidamine) (Nath et coll., 2016) mais sans autorisation de mise sur le marché à ce jour en France.

Tableau 20.II Principaux types d’usages des fongicides SDHi autorisés en France

Sources : Anses, 2019 ; Pesticide Properties DataBase (https://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/ [consulté le 14 mai 2020]) ; rapports Efsa et Echa (EU Pesticide Database : https://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database [consulté le 14 mai 2020]). Les données correspondent aux règlements en vigueur à la date de consultation des bases de données.

Tableau 20.III Principaux types d’usages des fongicides SDHi anciennement autorisés en France

Source : Base CIPA (Compilation des Index phytosanitaires ACTA), un outil du programme Matphyto disponible à l’adresse http://matphyto.acta-informatique.fr/ [consulté le 14 mai 2020].

Contamination des milieux et des denrées alimentaires

Surveillance dans les différents milieux

Une étude récente sur les résidus de pesticides dans les terres agricoles en Europe a montré que le boscalide est détecté dans 27 % des 317 échantillons testés à une concentration médiane de 0,04 mg/kg (maximum 0,41 mg/kg) (Silva et coll., 2019). Une autre étude plus restreinte menée en Allemagne sur des sols sableux a détecté le boscalide, 3 ans après son application, à une concentration moyenne de 0,2 µg/kg (Karlsson et coll., 2016). La demi-vie (DT₅₀) des fongicides SDHi dans les sols varie selon les substances actives, les types d’études (études de laboratoire ou de terrain), les conditions environnementales (température, humidité) et les types de sol. Dans le rapport Anses de 2019, le groupe d’experts a compilé les données sur les DT₅₀ des fongicides SDHi dans les sols à partir des évaluations de risques publiées par l’Autorité européenne de sécurité des aliments (European Food Safety Authority ; Efsa). Ont été rapportées les données obtenues sur l’ensemble des substances actives autorisées au niveau européen en janvier 2019 (à l’exception du penflufène). Les valeurs les plus faibles sont retrouvées pour la carboxine avec une DT₅₀ moyenne de 0,28 jours (DT₅₀ maximum 11 jours), l’isofétamide avec 37 jours et le sédaxane avec 100 jours. La persistance des autres substances SDHi est plus élevée comme par exemple le benzovindiflupyr, le flutolanil et le bixafène avec des DT₅₀ respectivement de 184, 190 et 203 jours. Dans le dernier rapport d’évaluation européenne du boscalide, les DT₅₀ rapportées sont de 108 à 384 jours à partir des études de laboratoire (moyenne 232 jours), et de 27 à 208 jours dans les études de terrain (C.E., 2008). Des valeurs du même ordre (entre 182 et 572 jours) ont été rapportées dans des dossiers de l’agence américaine de la protection de l’environnement (EPA, 2010). Enfin, des données sont disponibles pour quelques fongicides SDHi qui font l’objet d’une demande d’autorisation au niveau européen, dont l’inpyrfluxame avec une demi-vie dans les sols de 121 à 1 720 jours (EPA, 2020), l’isoflucyprame avec une demi-vie de 224 à 630 jours dans les études de laboratoire et de 16,5 à 177 jours dans les études de terrain (Echa, 2018), et le pydiflumétofène avec une demi-vie moyenne de 1 334 jours (maximum de 8 540 jours) (Anses, 2019). La quasi-totalité des fongicides SDHi répondent donc aux critères d’une substance dite « persistante » dans les sols selon la réglementation européenne16

Une demi-vie dans le sol supérieure à 120 jours. Règlement (CE) n^o 1107/2009 du 21/10/09 concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques et abrogeant les directives 79/117/CEE et 91/414/CEE.

et leur utilisation à long terme peut ainsi conduire à leur accumulation, un phénomène qui a été montré par modélisation pour le boscalide (JMPR, 2009).

Les aquifères sont le réceptacle final de nombre de pesticides, ainsi, en France en 2013, des pesticides ont été détectés dans plus de 90 % des points de suivi des cours d’eau métropolitains par les agences de surveillance de l’eau (Commissariat général au développement durable, 2015). Les molécules les plus fréquemment détectées dans les cours d’eau (eau de surface) sont des herbicides. Parmi les 15 molécules les plus fréquemment détectées en 2013, le boscalide est en 8^e position. Il est le seul fongicide de ce top 15. Le taux de détection est inférieur à 20 % en 2012 et 2013. Parmi les 1 580 points de surveillance le concernant, aucun n’a dépassé le seuil d’écotoxicité (11,6 µg/l)17

Valeur guide environnementale (VGE) pour les eaux douces non destinées à la production d’eau potable. L’Institut national de l’environnement industriel et des risques (Ineris) indique pour le boscalide une VGE de 11,6 µg/l (moyenne annuelle)
https://substances.ineris.fr/fr/substance/cas/188425-85-6/3 [consulté le 24 juin 2020].

. La plupart des autres SDHi n’étant pas recherchés, la présence de ces molécules dans les hydrosystèmes n’est pas connue (Commissariat général au développement durable, 2015).

Surveillance dans les denrées alimentaires (végétales ou animales)

D’après le rapport de l’Anses (2019), les substances SDHi faisant l’objet d’une surveillance dans les denrées alimentaires destinées à la consommation humaine en France sont : le boscalide, le flutolanil, la carboxine, le bixafène, le fluopyram, le fluxapyroxade, le penthiopyrade et le benzovindiflupyr. Les résultats des programmes de surveillance et de contrôles mis en œuvre par les ministères de l’Agriculture et de la Consommation entre 2013 et 2016 montrent que le boscalide est quantifié18

Concentration égale ou supérieure aux taux de quantification équivalent habituellement à 3 fois le taux de détection.

dans 4,4 % à 8,7 % des échantillons de denrées prélevées à la distribution et dans 9,2 % à 12,7 % de denrées directement à la production. Concernant le flutolanil, le taux de quantification est de 0,02 % pour les denrées distribuées, et de 0,7 % pour les denrées à la production. Un seul dépassement de la limite maximale de résidus (LMR) est constaté sur un échantillon de carotte issu des denrées prélevées à la distribution. La carboxine n’a pas été quantifiée dans les denrées prélevées à la distribution et l’a été une seule fois sur les denrées à la production (sur 800 à 1 400 analyses annuelles) sans dépasser la LMR. Concernant les autres substances, le bixafène et le fluopyram sont quantifiés dans moins de 2,5 % des échantillons (sans dépassement de la LMR sauf pour un cas pour des kiwis et le fluopyram), le fluxapyroxade, le penthiopyrade et le benzovindiflupyr ne sont pas quantifiés.

Le boscalide a été mesuré dans des études de l’alimentation totale française menées par l’Anses dont l’EAT2 réalisée entre 2006 et 2011, et aussi plus récemment avec la carboxine, le flutolanil et le mépronil dans l’EATi, réalisée entre 2010 et 2016 et qui portait sur l’alimentation infantile. Dans l’EAT2, le boscalide a été quantifié dans 20 % des échantillons de fruits (n = 75) à des concentrations comprises entre 0,01 et 0,09 mg/kg et dans 1,5 % des échantillons de légumes (n = 263) à des concentrations comprises entre 0,03 et 0,250 mg/kg, sans aucun dépassement de la LMR (Nougadère et coll., 2012). Dans l’EATi, le boscalide a été quantifié dans 5 sur 305 des produits analysés (1,6 %) à des taux faibles, de l’ordre de 0,001 mg/kg, alors que la carboxine, le flutolanil et le mépronil n’ont pas été quantifiés (Nougadère et coll., 2020).

Au niveau européen, l’Efsa compile les données des programmes de contrôle nationaux menés par les États membres de l’UE, l’Islande et la Norvège. Concernant les données de 2018 (Efsa, 2020), 16 substances actives SDHi ont été étudiées (tableau 20.IV) : le boscalide et le fluopyram sont quantifiés dans respectivement 8,96 % et 6,75 % des échantillons analysés, un groupe de 7 substances sont quantifiées dans moins de 0,5 % des échantillons (le benzovindiflupyr, le bixafène, la carboxine, le flutolanil, le fluxapyroxade, l’isopyrazam et le penthiopyrade) et 7 substances ne sont quantifiées dans aucun des échantillons (le bénodanil, le fenfurame, l’isofétamide, le mépronil, l’oxycarboxine, le penflufène et le sédaxane). Seul le boscalide dépasse sur certains échantillons la LMR : sur 75 008 échantillons analysés pour cette substance, 61 (0,08 %) dépassent la LMR (8 sont des produits d’origine européenne, 53 d’origine extra-européenne).

Tableau 20.IV Analyse des niveaux de résidus de pesticides SDHi dans les aliments sur le marché européen : nombre d’échantillons analysés et nombre de quantifications

LQ : Limite de quantification. Source : Efsa, 2020

Enfin, une étude académique a examiné les résidus de plusieurs fongicides dont le boscalide dans les vins de différents pays. Le boscalide a été retrouvé dans 19,2 % de 250 vins testés à une concentration maximale de 0,136 mg/l (moyenne 0,03 mg/l) (Esteve-Turrillas et coll., 2016).

Biosurveillance humaine et sources d’exposition

L’Anses indique qu’il n’existe pas de données de biosurveillance humaine pour les SDHi, ces molécules n’ayant notamment pas été identifiées comme prioritaires lors de l’établissement de la liste des substances à inclure dans le programme national de biosurveillance (Anses, 2019).

Dans une étude académique analysant un échantillon de 311 femmes de la cohorte ELFE recrutées en maternité en 2011 en France métropolitaine, le boscalide a été détecté dans les cheveux de 195 femmes (63 %) avec une concentration médiane de 0,55 pg/mg de cheveux (Béranger et coll., 2018 ; Béranger et coll., 2020). Parmi un échantillon de 16 individus participant à une étude interventionnelle portant sur l’impact de l’alimentation d’origine biologique sur l’imprégnation urinaire aux États-Unis, aucune mesure réalisée avant et après l’intervention ne rapportait la présence du boscalide dans les urines (Hyland et coll., 2019).

Dans une d’étude académique préliminaire, chez les fleuristes en Belgique sur un faible effectif (n = 14), le boscalide a été détecté dans les urines à des concentrations comprises entre 0,49 et 0,82 µg/l (Toumi et coll., 2020). D’autres auteurs ont évalué, par modélisation, l’exposition à la carboxine par voie cutanée et par inhalation chez les personnes travaillant en floriculture sous serres en Colombie (Lesmes-Fabian et Binder, 2013) ou, dans une étude menée aux États-Unis, chez des personnes traitant les semences (Grey et coll., 1983).

Toxicocinétique

Conséquences biologiques d’une altération de la fonction
de la succinate déshydrogénase

Succinate et production d’espèces réactives de l’oxygène

Bien que les complexes I et III de la chaîne respiratoire soient des sites majeurs de production de ROS, le complexe II peut également y participer suite au blocage de son activité. Ainsi lorsque le complexe II est perturbé au niveau des sous-unités de la SDH (voir aussi ci-dessous), l’oxydation du succinate et le transfert d’électrons au groupement flavine de la SDHA pourraient se produire normalement, tandis que le transfert ultérieur des électrons vers les centres fer-soufre de la SDHB et l’ubiquinone est altéré, favorisant la production de superoxyde par l’auto-oxydation du groupement flavine réduit par l’oxygène dans la matrice (Rustin et Rötig, 2002). La production de ROS par ciblage du complexe II par des agents chimio-thérapeutiques serait dépendante des modifications du pH intracellulaire et mitochondrial matriciel, et entraînerait la mort cellulaire par apoptose (Lemarie et coll., 2011). Le stress oxydant peut être associé à des syndromes neurodégénératifs, comme la maladie de Parkinson, d’Alzheimer ou de Huntington (Ebadi et coll., 2001 ; Lin et Beal, 2006 ; Niedzielska et coll., 2016 ; Trist et coll., 2019). Il peut aussi faciliter la promotion et la progression tumorale (Liou et Storz, 2010) en altérant la signalisation cellulaire et en causant des dommages oxydatifs à l’ADN (Tamura et coll., 2014 ; Galadari et coll., 2017 ; Prasad et coll., 2017).

Des études fonctionnelles dans des modèles de levure présentant des délétions ou des mutations ponctuelles dans les orthologues des gènes SDHA, SDHB, SDHC et SDHD humains ont pu démontrer que l’inactivation de la SDH est associée à une augmentation de la production de ROS qui s’accompagne d’une instabilité génomique (Smith et coll., 2007 ; Szeto et coll., 2007 ; Goffrini et coll., 2009). D’autres études suggèrent que des mutations dans les sous-unités B, C et D pourraient également influencer la production d’anion superoxyde au niveau du site de liaison de l’ubiquinone sur la SDHD (Guo et Lemire, 2003 ; Szeto et coll., 2007). Plus récemment, il a été montré que l’inactivation de la SDHC dans des cellules humaines d’hépatocarcinome conduit à une augmentation de la production de ROS (Li et coll., 2019). De manière similaire, dans des lignées cellulaires humaines d’hépatome Hep3B, de carcinome pulmonaire A549 et d’ostéosarcome dans lesquelles la SDHB a été inactivée par ARN interférence ou « pharmacologiquement » (par traitement avec le TTFA), on observe un stress oxydant associé à la stabilisation nucléaire du facteur de transcription HIF-α (Hypoxia Inducible Factor alpha) en conditions normoxiques (Guzy et coll., 2008). Dans des cellules de hamster exprimant une version normale ou une version mutée du gène SDHC humain, il se produit une augmentation des niveaux d’anion superoxyde et de peroxyde d’hydrogène qui s’accompagne d’une activation de la superoxyde dismutase et du métabolisme du glutathion, cohérente avec la mise en place des mécanismes de défense contre le stress oxydant. Ce phénomène est associé à un stress métabolique caractérisé par une augmentation de la consommation de glucose. L’ensemble de ces désordres sont prévenus par une réexpression du gène SDHC (Slane et coll., 2006). Enfin, l’inhibition de la SDH par l’atpenin A5, un inhibiteur pharmacologique du complexe II de la chaîne respiratoire, doté de propriétés antifongiques et nématicides (Selby et coll., 2010 ; Lee et coll., 2019), induit également un stress oxydant dans les cellules tumorales coliques humaines HT29 et DLD-1 mais pas dans des fibroblastes normaux (Paranagama et Kita, 2017). La production de ROS résultant d’un déficit en SDH peut également favoriser la transduction d’un signal de stabilisation du facteur de transcription d’HIF-1α en oxydant le Fe²⁺ en Fe³⁺, car le Fe²⁺ est un cofacteur critique des prolyl-hydroxylases responsables de l’hydroxylation d’HIF1 (Zhao et coll., 2017).

Succinate, HIF1 et pseudo-hypoxie

L’une des conséquences de l’accumulation de succinate dans le cytosol est l’inhibition de l’activité des HIF prolyl-hydroxylases (PHD) qui contrôlent la stabilité de HIF-1α et donc le devenir du facteur de transcription HIF1 responsable de la réponse à l’hypoxie (Selak et coll., 2005). La fonction physiologique d’HIF1 est de favoriser l’adaptation des cellules à la fluctuation du niveau de dioxygène (O₂). En situation de normoxie, le complexe HIF1 est maintenu à un faible niveau grâce à sa dégradation régulière par le protéasome, après son hydroxylation par les PHD dont l’activité est dépendante du dioxygène.

Au cours de la tumorigenèse, l’accroissement du volume tumoral entraîne une hypoxie transitoire au centre de la tumeur, qui favorise la stabilisation d’HIF1 (dimère de HIF1α et HIF1β). Ce facteur de transcription sensible à l’hypoxie va alors stimuler l’expression des gènes impliqués dans la néovascularisation comme le VEGF (Bernaudin et coll., 2002) ou dans le transport du glucose et la glycolyse (Vander Heiden et coll., 2009) et favoriser une reprogrammation métabolique propice à la promotion et à la progression tumorale. Ce remodelage métabolique, connu sous le nom d’effet Warburg, constitue un marqueur du phénotype tumoral commun à la plupart des cellules cancéreuses. Il favorise la glycolyse aux dépens de l’activité du cycle de Krebs couplé à la chaîne respiratoire des mitochondries, pour fournir les métabolites nécessaires à une prolifération rapide des cellules cancéreuses, ainsi que les cofacteurs nécessaires à leur lutte contre le stress oxydant (Vander Heiden et coll., 2009). Le succinate est un inhibiteur compétitif des PHD (Xiao et coll., 2012 ; Her et coll., 2015 ; Peters et coll., 2015). En bloquant l’hydroxylation d’HIF1 par les PHD, une élévation du succinate pourrait induire la stabilisation de ce facteur de transcription même dans des conditions de normoxie, avec des conséquences sur le développement du phénotype tumoral.

Dans des tumeurs de type PGL et PCC présentant une augmentation du niveau de succinate liée à une inactivation complète de l’un des gènes SDH, il a été mis en évidence une surexpression d’HIF1 (Pollard et coll., 2005 ; Gimenez-Roqueplo, 2006), liée à une inhibition de l’activité des PHD par le succinate. C’est également le cas dans des cellules transfectées avec un siARN dirigé contre SDHB (cellules hépatiques Hep3b et cellules d’adénocarcinome gastrique AGS) (Cervera et coll., 2009) et dans des fibroblastes de patients présentant une inactivation complète du gène SDHA (Brière et coll., 2005). HIF1 concourt à l’activation de processus favorables à la cancérogenèse, notamment par la promotion d’une reprogrammation métabolique propice à la prolifération cellulaire. Ces caractéristiques ont conduit à considérer que l’inactivation des gènes SDHx entraîne la mise en place d’un phénotype de pseudo-hypoxie et à qualifier ces gènes de suppresseurs de tumeur. On peut également noter que l’accumulation de succinate observée dans des macrophages humains THP1 en réponse à une exposition à l’inhibiteur pharmacologique du complexe II atpenin A5 est également associée à une augmentation du niveau d’HIF-1α (Fuhrmann et coll., 2019).

Succinate et régulation épigénétique

Le succinate, comme le fumarate et le 2-hydroxyglutarate, appartient à la famille des « oncométabolites ». Une augmentation de leur concentration cellulaire entraîne une dérégulation de l’homéostasie métabolique au sein du cycle de Krebs qui favorise la reprogrammation métabolique propice à la cancérogenèse évoquée plus haut (Nowicki et Gottlieb, 2015).

Le succinate joue un rôle crucial dans les régulations épigénétiques, en particulier en inhibant l’activité de déméthylases de l’ADN (figure 20.3). La méthylation de l’ADN est une modification chimique qui affecte les bases C au sein de dinucléotides CpG. Cette modification épigénétique, lorsqu’elle affecte les régions promotrices des gènes, permet de contrôler l’activité des gènes dans différents tissus et en réponse à différents stimuli nutritionnels, hormonaux ou environnementaux, sans modifier la séquence primaire d’ADN. La méthylation de l’ADN affecte la structure de la chromatine et est fréquemment associée à une répression des gènes. Elle peut être réversée par des enzymes possédant une activité déméthylase de la famille TET (ten-eleven-translocation) qui catalysent l’oxydation des 5-méthyl-cytosines en 5-hydroxy-méthyl-cytosine. Ce signal moléculaire de déméthylation est alors associé à une activation de la transcription des gènes (Vasanthakumar et Godley, 2015). Le succinate est un inhibiteur des déméthylases de la famille TET, avec une concentration inhibitrice médiane (IC₅₀) de l’ordre de 550 µM (Laukka et coll., 2016), une valeur compatible avec le niveau de succinate dans les tumeurs SDHx qui peut atteindre plusieurs millimolaires (Pollard et coll., 2005 ; Xiao et coll., 2012). Son accumulation est donc susceptible de modifier la méthylation de l’ADN et il est connu que les altérations du profil de méthylation des gènes sont souvent impliquées dans le processus de cancérogenèse.

Figure 20.3 Conséquences potentielles d’une accumulation de succinate sur la reprogrammation métabolique et la régulation de l’épigénome

Figure 20.3

Figure 20.3 Conséquences potentielles d’une accumulation de succinate sur la reprogrammation métabolique et la régulation de l’épigénome

L’accumulation de succinate pourrait entraîner une dérégulation de l’homéostasie métabolique, une inhibition des PHD (prolyl hydroxylases) responsables de la stabilisation d’HIF1 et de la mise en place d’une pseudo-hypoxie, et l’inhibition d’histones et d’ADN déméthylases responsables de la régulation de l’épigénome et par conséquent, du transcriptome. L’ensemble de ces évènements moléculaires pourrait avoir un impact sur la cancérogenèse.

Dans les tumeurs PGL et PCC associées aux mutations des gènes SDHx, un phénotype hyperméthylé de l’ADN au niveau du génome entier a été observé, affectant les promoteurs de plus de 4 000 gènes. Ces altérations du méthylome ont des conséquences importantes sur le répertoire transcriptionnel des tumeurs, avec la diminution du niveau d’expression d’environ 200 gènes hyperméthylés. Parmi ces gènes, ont été identifiés des gènes suppresseurs de tumeurs ou encore des gènes associés à la transition épithélio-mésenchymateuse, un processus crucial qui permet aux cellules cancéreuses de quitter leur tissu d’origine et de migrer vers d’autres organes pour former des métastases. L’extinction de ces gènes en réponse à l’hyperméthylation de leurs régions promotrices pourrait expliquer, au moins en partie, la dédifférenciation des cellules chromaffines au sein des PGL et PCC et le caractère invasif des tumeurs associées à une mutation du gène SDHB (Letouzé et coll., 2013). En accord avec cette hypothèse, l’inactivation génétique de SDHB dans des cellules chromaffines de souris entraîne une accumulation de succinate qui agit comme un inhibiteur compétitif des déméthylases de la famille TET, conduisant à une accumulation progressive de cytosines méthylées. Le phénotype hyperméthylé qui en résulte reproduit celui observé dans les tumeurs humaines portant une mutation SDHB à l’état homozygote et est associé à des capacités migratoires augmentées des cellules chromaffines ainsi modifiées (Letouzé et coll., 2013).

Le succinate est aussi un inhibiteur compétitif des histones déméthylases dépendantes de l’α-cétoglutarate avec un IC₅₀ de l’ordre de 0,8 mM (Xiao et coll., 2012). L’accumulation de succinate est donc également associée à une augmentation de la méthylation des histones (figure 20.3). Les histones sont les protéines formant les nucléosomes de la chromatine. Elles subissent des modifications post-traductionnelles qui modulent l’accessibilité de l’ADN, donc des gènes, à la machinerie transcriptionnelle. C’est principalement l’extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique des histones qui émerge des nucléosomes, qui subit ces nombreuses modifications post-traductionnelles. La nature de ces modifications est diverse incluant notamment la phosphorylation, l’acétylation, l’ubiquitinylation et la méthylation. Concernant ce dernier type de modulation, les histones peuvent être mono-, di-, ou triméthylés. La méthylation des lysines 9 et 27 de l’histone H3 (H3K9 et H3K27, respectivement) est associée à une répression de la transcription.

Dans les tumeurs impliquant une inactivation de la SDH, plusieurs travaux ont montré que l’accumulation de succinate modifie l’épigénome via une hyperméthylation des histones. Ainsi, dans les tumeurs humaines associées à une inactivation du gène SDHB, les cellules chromaffines de souris et les cellules tumorales ovariennes de souris dans lesquelles le gène Sdhb a été inactivé, une augmentation du niveau de méthylation des histones H3K9 triméthylés et H3K27 di- et triméthylés a été mise en évidence (Letouzé et coll., 2013 ; Aspuria et coll., 2014). Dans les cellules embryonnaires rénales humaines HEK293T, l’inactivation de SDHA ou SDHB par ARN interférence (utilisation de siARN) entraîne une augmentation du niveau des histones H3K4 mono-, di- et triméthylés, et H3K79 diméthylés. Cette hyperméthylation des histones est retrouvée dans les cellules humaines d’hépatocarcinome Hep3B, de fibrosarcome HT1080 et de phéochromo-cytome de rat PC12 suite à une inhibition de la SDH par un traitement avec 0,5 mM de TTFA pendant 24 h (Cervera et coll., 2009), avec des profils d’hyperméthylation de l’histone H3 différents selon les lignées cellulaires utilisées.

Bien que les données sur l’inactivation partielle ou totale de la SDH par mutations génétiques soient plus étayées que celles sur l’inhibition chimique, il est important de noter que les inhibiteurs pharmacologiques de la SDH (notamment le TTFA, l’atpenin) ou la présence de succinate (notamment sous forme de diméthyl-succinate) entraînent, dans le contexte particulier d’expérimentations sur des modèles cellulaires, des effets similaires à ceux décrits dans le cas des altérations génétiques de la SDH. En effet, ces molécules sont capables d’induire in vitro une pseudo-hypoxie par changement de l’activité de la PHD ainsi qu’un stress oxydant, une hyperméthylation des îlots CpG et une hyperméthylation des histones (Guzy et coll., 2008 ; Cervera et coll., 2009 ; Lemarie et coll., 2011 ; Wentzel et coll., 2017).

Succinate, SDH et transition épithélio-mésenchymateuse

La transition épithélio-mésenchymateuse (Epithelial-Mesenchymal Transition ; EMT) constitue l’une des premières étapes nécessaires au processus métastatique. Ce phénomène dynamique et réversible repose sur des modifications morphologiques et fonctionnelles complexes de la cellule tumorale, nécessaires à l’acquisition d’un phénotype invasif (figure 20.4). L’EMT se caractérise par la perte des propriétés de polarité et d’adhérence caractéristiques des cellules épithéliales, et l’acquisition de propriétés de mobilité et d’invasion propres aux cellules mésenchymateuses (Thiery et coll., 2009).

Ce processus est caractérisé par de profonds changements transcriptionnels (Lamouille et coll., 2014) et épigénétiques (McDonald et coll., 2011 ; Tam et Weinberg, 2013), liés à un remodelage métabolique affectant le métabolisme du glucose, des lipides, de la glutamine et des nucléotides (Sciacovelli et Frezza, 2017). La connexion étroite entre l’EMT et le métabolisme mitochondrial a notamment été établie par la démonstration d’une signature moléculaire caractéristique de l’EMT dans des tumeurs porteuses de mutations dans des gènes codant des enzymes du cycle de Krebs, dont la SDH (Loriot et coll., 2012). Certains travaux mettent également en évidence que l’EMT peut être impliquée dans l’émergence de propriétés caractéristiques des cellules souches cancéreuses (Puisieux et coll., 2014 ; Ye et Weinberg, 2015), incluant la chimiorésistance avec une surexpression de gènes codant des pompes d’efflux de médicaments (Du et Shim, 2016), et la dormance tumorale (Giancotti, 2013).

Figure 20.4 Représentation schématique des modifications cellulaires intervenant lors de la mise en place de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) (d’après Dongre et Weinberg, 2019)

Figure 20.4

Figure 20.4 Représentation schématique des modifications cellulaires intervenant lors de la mise en place de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) (d’après Dongre et Weinberg, 2019)

Les cellules épithéliales présentent une polarité « baso-apicale » et sont maintenues entre elles par des jonctions serrées, des jonctions adhérentes et des desmosomes. Elles sont liées à la membrane basale par des hémidesmosomes. Ces cellules expriment des molécules caractéristiques de l’état épithélial impliquées dans le maintien de la polarité cellulaire. L’induction de la EMT (transition épithélio-mésenchymateuse) conduit à l’expression des facteurs de transcription ZEB, SNAIL et TWIST, qui inhibent l’expression des gènes associés à l’état épithélial et activent simultanément l’expression des gènes associés à l’état mésenchymateux. Ces changements entraînent le désassemblage des jonctions intercellulaires et la disparition de la polarité. La perte progressive des caractéristiques épithéliales s’accompagne de l’acquisition d’un ensemble de caractéristiques mésenchymateuses avec une polarité « avant-arrière », un cytosquelette largement réorganisé et des marqueurs mésenchymateux.
TME : transition mésenchymo-épithéliale.
(Figure traduite de l’anglais)

Loriot et coll. ont montré que les PCC et les PGL métastatiques humains porteurs de mutations du gène SDHB sont invasifs et présentent une activation des facteurs de transcription Snail 1 et Snail 2 qui gouvernent la mise en place de l’EMT suggérant l’induction d’une EMT dans ces tumeurs (Loriot et coll., 2012). Confirmant cette hypothèse, l’inactivation du gène SDHB dans les cellules chromaffines de souris induit l’expression de ces facteurs de transcription et conduit à une augmentation des capacités migratoires, partiellement bloquée par la décitabine, un inhibiteur de la méthylation de l’ADN (Letouzé et coll., 2013 ; Loriot et coll., 2015). Le lien entre le déficit en SDHB et l’EMT a également été démontré dans le cancer colorectal, où l’inactivation du gène SDHB favorise la migration et l’invasion cellulaires via un mécanisme impliquant le TGF-β et le facteur de transcription Snail1 (Wang et coll., 2016), ainsi que dans le cancer ovarien (Aspuria et coll., 2014).

Une autre observation est que les gènes SDHA et SDHB sont fréquemment sous-exprimés dans les carcinomes hépatocellulaires humains (Shimizu et coll., 2014). Chez les patients présentant des tumeurs hépatocellulaires, cette atténuation de l’expression de la SDH est associée à la progression tumorale et à une diminution de la survie des patients (Li et coll., 2019). Dans des cellules d’hépatocarcinome, l’inactivation du gène SDHC induit une augmentation du niveau de succinate et favorise la prolifération cellulaire et la mise en place d’une EMT, avec la diminution des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine et zonula occludens-1) et une augmentation des marqueurs mésenchymateux (vimentine et N-cadhérine). Ces observations s’accompagnent d’une augmentation des capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales (Li et coll., 2019). De manière similaire, l’inactivation du gène SDHB dans les cellules d’hépatocarcinome Hep3B induit une EMT caractérisée par une diminution du marqueur épithélial E-cadhérine et une augmentation des marqueurs mésenchymateux N-cadhérine, vimentine et des facteurs de transcription contrôlant l’EMT (Twist, Slug et Snail). La mise en place de cette EMT s’accompagne d’une augmentation des capacités de prolifération et de migration des cellules tumorales (Tseng et coll., 2018).

Bien que l’ensemble de ces études ne se soient pas spécifiquement axées sur l’accumulation de succinate comme médiateur de l’EMT, il a été récemment montré que le succinate, tout comme le fumarate, peut induire la suppression épigénétique de miARN de la famille miR-200 et leur induction ultérieure dans les cellules rénales épithéliales déficientes en SDHB (Sciacovelli et coll., 2016).

Données toxicologiques concernant les fongicides SDHi

Ces dernières années, il est apparu que l’exposition à des contaminants environnementaux incluant certains pesticides pouvait favoriser un dysfonctionnement mitochondrial. C’est le cas pour le paraquat (Tawara et coll., 1996 ; Cochemé et Murphy, 2008), le manèbe (Zhang et coll., 2003 ; Domico et coll., 2006), et la roténone (Betarbet et coll., 2000 ; Navarro et coll., 2010) qui perturbent la respiration cellulaire en bloquant l’activité des complexes I et/ou III de la chaîne respiratoire des mitochondries et sont suspectés de jouer un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson (Costello et coll., 2009 ; Tanner et coll., 2011 ; Wang et coll., 2011).

Inhibition de la succinate déshydrogénase : analyses structurales
(in silico) et fonctionnelles (in vitro)

Structure protéique de la SDH et site de fixation des SDHi

L’analyse des séquences nucléotidiques des sous-unités de la SDH montre une identité/similarité très importante entre les espèces (champignons, levure, l’être humain), notamment pour SDHA et B et plus faible pour SDHC et D (Huang et Millar, 2013). Non seulement les séquences mais aussi les structures déterminées par cristallographie aux rayons X sont semblables et, en premier lieu, le site de liaison de l’ubiquinone et des fongicides SDHi (Q-site). L’étude de mutations spontanées ou induites (ciblées ou non) apporte des informations sur l’activité du complexe II mitochondrial. Le site de liaison du succinate est localisé dans la sous-unité SDHA et le Q-site implique des acides aminés des sous-unités SDHB, SDHC et SDHD (Cecchini, 2003 ; Lalève et coll., 2014).

Récemment, une analyse d’identité/similarité des séquences SDHx a été réalisée dans une étude expérimentale in vitro qui avait pour objectif d’explorer les effets potentiels des SDHi chez les espèces non-cibles. L’analyse bio-informatique des séquences d’acides aminés des sous-unités SDHB, SDHC et SDHD de 22 espèces a abouti à la même conclusion quant à un fort degré de conservation. Douze acides aminés sont importants pour la fixation des SDHi (figure 20.5), 5 d’entre eux sont identiques entre les espèces comparées alors que les autres sont différents mais les changements sont conservatifs (Bénit et coll., 2019).

Parmi les mutations responsables d’un phénotype de résistance au boscalide, il est très souvent identifié chez Botrytis cinerea les mutations du gène Sdhb touchant les acides aminés Pro225 et His272 (Yin et coll., 2011) (dénommées ci-après SdhB-Pro225 et SdhB-His272 ; locus et acides aminés correspondant chez l’être humain ou le porc à respectivement SDHB-Pro197 et SDHB-His249). Une trentaine de mutations ont été identifiées comme responsables de la résistance aux fongicides et les plus fréquentes chez B. cinerea sont, comme précédemment, SdhB-Pro225 et SdhB-His272 avec de plus SdhB-Asn230 (Sierotzki et Scalliet, 2013), locus et acide aminé de ce dernier correspondant chez l’être humain (ou le porc) à SDHB-Asn202. Ces mutations sont pour partie dans la région du Q-site identifié en radiocristallographie (Yankovskaya et coll., 2003 ; Sun et coll., 2005). Il est intéressant de noter que des mutations de l’acide aminé SdhB-Pro225 chez B. cinerea (correspondant à SDHB-Pro197 chez l’être humain), conduisant à une résistance aux SDHi ont été retrouvées chez des patientes atteintes de PCC/PGL (Andrews et coll., 2018).

La structure cristallographique du complexe II de mitochondries de cœur de porc a été résolue ainsi que le complexe en présence du TTFA, un inhibiteur classique de la réduction de l’ubiquinone qui se loge dans le Q-site (Sun et coll., 2005). Le Q-site est formé par l’hélice 2L (SDHC ; aa 38-52), l’hélice 2S (SDHD ; aa 77-91) et les sites de liaison des complexes Fe-S (SDHB ; aa 166-175 et 214-219). Une similarité structurale entre le Q-site du complexe SQR d’E. coli et de mitochondries de porc renforce la notion de permanence structurale du complexe entre les organismes (Yankovskaya et coll., 2003 ; Sun et coll., 2005 ; Horsefield et coll., 2006 ; Ruprecht et coll., 2009). Cependant, peu de structures cristallographiques du complexe mitochondrial SQR ont été publiées et de nombreux articles portent sur des comparaisons de séquences non validées au plan d’une structure à résolution atomique. Ainsi si les structures sont semblables, elles peuvent différer légèrement entre espèces avec des affinités différentes pour les inhibiteurs au site de liaison de l’ubiquinone.

Figure 20.5 Représentation schématique de l’interaction des SDHi avec le site de liaison de l’ubiquinone du complexe II mitochondrial (d’après Bénit et coll., 2019)

Figure 20.5

Figure 20.5 Représentation schématique de l’interaction des SDHi avec le site de liaison de l’ubiquinone du complexe II mitochondrial (d’après Bénit et coll., 2019)

Les SDHi (représentés par la molécule entourée par la ligne pointillée) interagissent via leur groupement acide (en jaune) et amine (en bleu) avec des résidus d’acides aminés conservés (en gras) dans la cavité polaire (en rouge), la cavité hydrophobe (en bleu), ou le sillon de surface (en vert) des sous-unités SDHB, SDHC ou SDHD. À noter, la numérotation, qui diffère de celle dans le texte, est basée sur la séquence de Botrytis cinerea
(Figure traduite de l’anglais)

Inhibition in vitro de l’activité de la succinate déshydrogénase de différentes espèces par les SDHi

Récemment, les IC₅₀ de huit SDHi ont été mesurées dans des préparations enrichies en mitochondries obtenues à partir de cellules humaines, de lombric, d’abeille, et de champignon. Ces mesures montrent un potentiel inhibiteur des SDHi sur l’activité de la SDH, de l’ordre du micromolaire chez le champignon et l’être humain, avec des variations en fonction du SDHi utilisé (figure 20.6) (Bénit et coll., 2019). Cependant, il faut noter que la préparation des extraits varie en fonction de l’espèce, allant d’une purification de mitochondries (B. cinerea, Apis mellifera), sans indication de critères de qualité des préparations mitochondriales, à un lysat (Lumbricus terrestris, Homo sapiens) et réalisée à partir d’une seule préparation par organisme.

Une autre étude a mesuré les valeurs d’IC₅₀ du flutolanil sur l’activité SDH entre l’ascaris et son hôte, le porc, et a montré qu’elles sont très différentes, respectivement de 0,058 µM et 45,9 µM alors qu’il y a conservation de la structure du complexe II (Inaoka et coll., 2015). Cette différence (facteur d’environ 800 fois) est expliquée par la liaison plus forte du flutolanil dans la structure de la SDH d’ascaris évaluée d’après des données cristallographiques (Inaoka et coll., 2015). D’autres études, publiées par des industriels des phytosanitaires, ont comparé les IC₅₀ des SDHi entre espèces. Nakano et coll. ont montré que les IC₅₀ du pyflubumide pour la SDH d’un acarien (Tetranychus urticae), du rat et de la truite présentent une variabilité importante, de l’ordre de 400 fois (Nakano et coll., 2015). Une deuxième étude a montré des différences d’IC₅₀ entre 7 800 et 17 700 fois entre la souris et deux champignons (B. cinerea et Sclerotinia sclerotiorum) respectivement pour le pyraziflumid, mais cet article ne précise pas la nature des échantillons biologiques sur lesquels les mesures ont été réalisées (Kikutake et coll., 2020). Les études disponibles suggèrent donc que les valeurs d’IC₅₀ pourraient être très différentes d’une espèce à l’autre mais ne permettent pas d’évaluer objectivement la spécificité des SDHi vis-à-vis des champignons au regard d’espèces non-cibles. Cette caractérisation requiert des études supplémentaires rigoureuses, en particulier quant à la nature, l’homogénéité et la préparation des échantillons biologiques sur lesquels sont mesurées les IC₅₀.

Figure 20.6 Potentiel inhibiteur des SDHi sur la SDH mesurée sur des préparations de mitochondries de différents organismes (d’après Bénit et coll., 2019)

Figure 20.6

Figure 20.6 Potentiel inhibiteur des SDHi sur la SDH mesurée sur des préparations de mitochondries de différents organismes (d’après Bénit et coll., 2019)

Les graphiques montrent les concentrations inhibitrices médianes (IC₅₀) des substances actives testées par l’activité de la succinate-cytochrome c-réductase (SCCR).
(Figure traduite de l’anglais)

Sensibilité aux SDHi de cellules de patients présentant un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire

Dans les fibroblastes de patients présentant une altération de la chaîne respiratoire liée ou non à un déficit d’origine génétique en SDH (un patient avec un syndrome de Leigh porteur d’une mutation homozygote du gène SDHA, un patient avec une ataxie de Friedreich et un patient avec une maladie d’Alzheimer familiale), il a été observé une sensibilité accrue au bixafène et au fluxapyroxade par rapport à des fibroblastes de sujets contrôles, avec une augmentation significative du stress oxydant et de la mort cellulaire (Bénit et coll., 2019). Les auteurs de cette étude, à partir de ces données limitées soulèvent l’hypothèse que les personnes atteintes d’un dysfonctionnement mitochondrial, en particulier touchant la chaîne respiratoire, pourraient présenter une susceptibilité accrue aux éventuels effets toxiques des SDHi.

Génotoxicité et cancérogénicité

Les tests effectués incluent des essais de génotoxicité et de mutagenèse in vitro (sur cellules bactériennes et cellules de mammifères en culture) et in vivo (sur des cellules somatiques et germinales de mammifères prélevées sur des animaux exposés), ainsi que des tests de cancérogénicité sur des modèles animaux (généralement rongeurs). Ces premiers tests concluent pour la majorité des SDHi à une absence de génotoxicité (tableau 20.V). Une étude provenant d’une équipe de recherche académique s’intéressant à l’effet du bénodanil sur des lymphocytes humains rapporte un résultat négatif pour l’essai du micronoyau qui évalue un effet de cassure ou d’anomalie de répartition des chromosomes entre les cellules filles (effet clastogène ou aneugène, respectivement) (Akyil et coll., 2016).

En ce qui concerne l’évaluation réglementaire de la cancérogénicité au niveau européen, les tests sont réalisés in vivo après une administration répétée pendant 2 ans chez le rat et 18 mois à 2 ans chez la souris suivant la ligne directrice OCDE TG 451 ou une combinaison entre cancérogenèse (2 ans) et test de toxicité chronique (TG 453). Les données publiées par l’Efsa et l’Echa montrent que la plupart des SDHi augmentent l’incidence des adénomes et des carcinomes dans différents organes, principalement le foie mais aussi la thyroïde, le poumon et l’utérus (tableau 20.V), avec pour certains un dimorphisme sexuel puisque les atteintes ne sont pas les mêmes chez les animaux mâles et les femelles (tumeurs hépatiques et thyroïdiennes, astrocytomes).

Tableau 20.V Génotoxicité, cancérogénicité et classification cancérogène des fongicides SDHi autorisés au niveau européen (d’après Anses, 2019 ; rapports Efsa, site de l’Echa¹)

Classification harmonisée (Règlement CE n^o 1272/2008) Carc 2 : « susceptible de provoquer le cancer » ; Carc 3 : « effet cancérogène suspecté, preuves insuffisantes ». Le cyflumétofène, un insecticide SDHi autorisé au niveau européen, est classé par Echa comme non génotoxique et fait l’objet d’une classification Carc 2.
¹ https://www.echa.europa.eu/fr/information-on-chemicals [consulté le 1^er avril 2020].
² Source : https://efsa.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.2903/j.efsa.2010.1857 [consulté le 27 août 2020]. À noter que la classification Efsa indiquée dans l’avis de l’Anses est « Carc 2 » (Anses, 2019).
³ Source : https://efsa.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.2903/j.efsa.2013.3052 [consulté le 27 août 2020]. À noter que la classification Efsa indiquée dans l’avis de l’Anses est « Carc 2 » (Anses, 2019).

Ces observations ont conduit l’Efsa à proposer le classement de certains SDHi comme cancérogènes de catégorie 2 mais ces propositions n’ont pas toujours été retenues par l’Echa. Sur la base de publications scientifiques réalisées par les firmes (Rouquié et coll., 2014 ; Tinwell et coll., 2014 ; Peffer et coll., 2018 ; Plummer et coll., 2018) ou d’études non publiées mais référencées en interne lors de l’évaluation réglementaire, le mécanisme d’action rapporté pour rendre compte des effets cancérigènes des SDHi évoque l’activation du récepteur nucléaire CAR (constitutive androstane receptor). Principalement considéré comme un récepteur de xénobiotiques (par exemple des pesticides et des médicaments) très exprimé dans le foie et l’intestin, mais se liant également à des molécules endogènes, l’activation de CAR déclenche la régulation transcriptionnelle d’enzymes (de la famille des cytochromes, des uridine diphospho glucuronyltransférases...) et de transporteurs intervenant dans la métabolisation et l’élimination de substances exogènes et endogènes. Son activation dans les hépatocytes de souris ou de rats stimule la synthèse de l’ADN et la prolifération cellulaire, favorisant ainsi le développement de lésions prénéoplasiques focales (nodules hyperplasiques) qui peuvent conduire à des tumeurs du foie bénignes (adénomes) ou malignes (carcinomes). Toutefois, ce mécanisme est considéré comme spécifique aux rongeurs car de nombreuses études in vitro et in vivo montrent que l’activation de CAR dans les cellules humaines n’induit pas la synthèse de l’ADN, comme il a été largement documenté pour l’hépato-cancérogenèse différentielle du phénobarbital entre le rat et l’être humain (Elcombe et coll., 2014). La problématique de la pertinence de ce mécanisme d’action pour l’être humain, et donc plus généralement du recours à des modèles de rongeurs dans le cadre de l’évaluation du potentiel cancérogène des substances chimiques fait encore l’objet de débat (Felter et coll., 2018). Par ailleurs, les études de cancérogénicité réalisées révèlent aussi l’apparition de tumeurs dans des tissus exprimant peu ce récepteur (thyroïde, utérus, ovaire...).

Toutefois, un mécanisme d’action impliquant CAR est également évoqué pour expliquer la survenue des tumeurs de la thyroïde chez les rongeurs observées en lien avec l’exposition à certains SDHi, notamment le sédaxane (Rouquié et coll., 2014), le fluopyram, le fluxapyroxade et le penthiopyrade sur la base d’un mécanisme reliant le métabolisme hépatique et la fonction thyroïdienne19

Sources : documents de l’Echa CLH-O-0000001412-86-46/F (https://echa.europa.eu/documents/10162/27e65bc5-6daf-118a-1f47-09fc774b6538), CLH-O-0000001412-86-254/F (https://echa.europa.eu/documents/10162/f21ff9a9-fbec-7faf-bc9e-c126f329599f), et CLH-O-0000001412-86-78/F
(https://echa.europa.eu/documents/10162/2095a6a7-e83b-1d9a-4d46-6b537c4739a7) [consulté le 14 septembre 2020].

. L’activation de CAR induit en effet l’expression hépatique de l’enzyme UGT1A1 (UDP-glucurunosyltransférase 1 polypeptide A1) qui intervient dans la clairance des hormones thyroïdiennes (HT) en stimulant la conjugaison et l’élimination biliaire de la thyroxine. Ce mécanisme de clairance exerce un rétrocontrôle sur l’axe hypothalamo-hypophysaire thyroïdien lequel conduit à une production compensatrice de TSH (thyroxin stimulating hormone). La TSH, en stimulant la thyroïde, participe à un processus d’hyperplasie qui, dans le cas d’une activation chronique, peut conduire à une tumeur. Ce mécanisme n’est pas transposable à la régulation du taux d’HT chez l’être humain qui exprime la thyroxine binding globulin (TBG) sérique, absente chez le rat, avec pour conséquence une demi-vie des HT plus courte chez le rat. De plus, la glande thyroïde stocke une quantité de thyroglobuline bien plus élevée chez l’être humain ce qui limite le recours à un état d’hyperplasie compensatrice (Hurley, 1998). Le cas particulier de l’association entre l’exposition à ces SDHi et la survenue de cancer de la thyroïde chez les rongeurs n’a pas été jugé pertinent pour l’être humain par les agences réglementaires, selon la mise en application du principe de déclassification « mode of action » en se référant aux critères établis par le WHO/IPCS (World Health Organization/International Programme on Chemical Safety) (Boobis et coll., 2006 ; Meek et coll., 2014).

Effets sur le développement et le système endocrinien

Toutes les substances testées sur les embryons (bixafène, boscalide, flutolanil, fluxapyroxade, isopyrazam, penthiopyrade, sédaxane, et thifluzamide) ont des effets toxiques et induisent des malformations et des anomalies de développement (œdème péricardique, scoliose, pigmentation, développement cérébral anormal) et de comportement. Ces effets sont associés, dans plusieurs de ces études, à des anomalies structurelles et fonctionnelles des mitochondries, à l’induction d’un stress oxydant et à une induction de l’apoptose et des altérations du métabolisme des lipides (Yang et coll., 2016b ; Yang et coll., 2016a ; Qian et coll., 2018a ; Teng et coll., 2018 ; Yao et coll., 2018b ; Yao et coll., 2018a ; Qian et coll., 2019a ; Yang et coll., 2019c ; Yang et coll., 2019b ; Li et coll., 2020a ; Li et coll., 2020b ; Wang et coll., 2020). À ces études s’ajoute une étude française récente qui montre que l’exposition des embryons au bixafène à des concentrations ≥ 0,2 µM (≥ 0,083 mg/l) provoque des anomalies du développement cérébral et une inhibition de la croissance des motoneurones spinaux (Brenet et coll., 2020).

Deux SDHi semblent aussi avoir des effets de perturbation endocrinienne chez les embryons : le thifluzamide qui conduit à une diminution de l’hormone de croissance dans des extraits d’embryons entiers à des concentrations ≥ 0,19 mg/l (Yang et coll., 2019b), et le flutolanil qui augmente la production des hormones thyroïdiennes tri-iodothyronine et thyroxine, et perturbe l’expression de plusieurs gènes intervenant dans la fonction thyroïdienne (TRH, TSHR, TPO, Dio1, TRα, et UGT1ab) à des concentrations ≥ 0,5 mg/l (Teng et coll., 2018). Ces deux SDHi augmentent également l’expression de la mélatonine et perturbent le cycle circadien (Yang et coll., 2019c ; Yang et coll., 2019b).

Tous les SDHi testés sur les poissons adultes ont un effet hépatotoxique avec des lésions (dégénérescence graisseuse et vacuolisation des hépatocytes) observées à partir de 21 jours d’exposition à 0,19 mg/l de thifluzamide (Yang et coll., 2016b ; Yang et coll., 2017 ; Yang et coll., 2018a ; Yang et coll., 2018b), après 28 jours d’exposition à 0,1 mg/l de boscalide (Qian et coll., 2019b) et après 60 jours d’exposition à 0,05 mg/l de flutolanil (Teng et coll., 2019). Une induction d’un stress oxydant et de l’apoptose et une altération du métabolisme des glucides et des lipides ont également été mises en évidence dans ces conditions expérimentales. Plus récemment, Qian et coll. ont montré que les poissons zèbres adultes exposés à 1 mg/l de boscalide pendant 21 jours présentent des anomalies histopathologiques de la rétine et du cerveau, ainsi qu’une diminution de la locomotion et de la capacité de prédation (Qian et coll., 2021). En outre, cette étude a mis en évidence des effets neurotoxiques chez les larves à partir de 4 jours d’exposition à 1,2 mg/l de boscalide.

Enfin, certains SDHi semblent avoir des effets de perturbation endocrinienne chez les poissons adultes. C’est le cas pour le thifluzamide qui stimule l’expression de l’hormone de croissance dans le foie et inhibe la sécrétion de la leptine (Yang et coll., 2019a). Le flutolanil, quant à lui, a un effet œstrogénique. Les poissons mâles exposés au flutolanil à des concentrations faibles (≥ 0,25 µg/l) pendant 60 jours montrent une augmentation de la concentration plasmatique de 17β-estradiol et une diminution de celle de testostérone (Teng et coll., 2020). L’exposition des poissons femelles au flutolanil conduit à une augmentation de la concentration plasmatique de 17β-estradiol et une perturbation du profil de méthylation génomique dans l’ovaire. Ces modifications ont pour conséquence des effets néfastes sur la reproduction. Les embryons issus des croisements des animaux exposés sont plus petits et ont un taux de mortalité plus élevé. Plus récemment, ce même groupe a montré que l’exposition pendant 21 jours à 1 mg/l de boscalide est associée à un effet oestrogénique chez les poissons mâles et que, contrairement au flutolanil, il possède une activité anti-oestrogénique chez les femelles (diminution du taux plasmatique de 17β-estradiol et peturbation de la fertilité) à des concentrations ≥ 0,01 mg/l (Qian et coll., 2020).

Ces effets toxiques semblent donc indiquer que les SDHi perturbent le développement, le métabolisme et certaines fonctions hormonales, et suggèrent que ces fongicides pourraient être considérés, au moins chez les poissons, comme des perturbateurs endocriniens. Cependant, il est à noter que les résultats in vivo suggérant une perturbation endocrinienne proviennent seulement de deux groupes et doivent être confirmés. Des données dans d’autres espèces et modèles expérimentaux n’ont pas été identifiées, sauf pour le boscalide qui inhibe l’expression de la prostaglandine D2 dans une lignée de cellules de souris (Kugathas et coll., 2016). Il est à noter que les rapports d’évaluation des risques de l’Efsa rapportent des effets perturbateurs endocriniens potentiels chez les rats pour le benzovindiflupyr (effets sur la reproduction), et pour le fluopyram et le penflufène, des lacunes dans les données n’ont pas permis à l’agence de conclure définitivement à l’absence d’effets perturbateurs endocriniens (Efsa, 2013 ; Efsa, 2015 ; Efsa, 2016).

Données d’écotoxicologie

SDHi et abeilles

Les abeilles mellifères peuvent être exposées aux pesticides pendant de longues périodes, à travers l’eau contaminée, le pollen et le nectar. Certaines plantes affichées comme favorisant les pollinisateurs se retrouvent contaminées par des pesticides dont des SDHi comme le boscalide ; une étude de 2017 utilisant la spectrométrie de masse, a détecté le boscalide dans les feuilles de 14 sur 29 espèces ou variétés de plantes mellifères à une concentration moyenne de 37 ng/g (Lentola et coll., 2017). Dans une étude conduite dans la région Rhône-Alpes, le boscalide est l’un des pesticides les plus détectés chez les abeilles, à des fréquences au moins aussi élevées que les néonicotinoïdes (14 %), et à des concentrations de 1 à 47,6 ng de boscalide/g de poids corporel (Daniele et coll., 2018). La cire ainsi que le pain d’abeille (nourriture des larves) sont également fréquemment contaminés par le boscalide par rapport à d’autres pesticides, avec des niveaux dans le pain d’abeille pouvant atteindre plus de 700 ng/g de pain (Daniele et coll., 2018). Dans la cire, le boscalide est détecté dans 39 % des échantillons avec des concentrations supérieures à 300 ng de boscalide/g de cire (Daniele et coll., 2018).

Dans une autre étude, concernant cette fois la région de l’East Sussex au Royaume-Uni, David et coll. ont décrit la présence de résidus de boscalide dans le pollen de colza (jusqu’à 25 ng/g) et le pollen de fleurs de bords de champs (jusqu’à 38 ng/g) (David et coll., 2016). Ces travaux mettent également en évidence que les abeilles qui collectent ce pollen rapportent les résidus à la ruche (jusqu’à 21 ng/g), bien que les quantités de boscalide détectées dans les abeilles soient moindres, de 0,24 à 9,8 ng/g de poids corporel (David et coll., 2016). Ces variations soulignent les différences de contamination des abeilles en fonction des régions et donc des cultures et traitements des parcelles. Dans une étude subséquente menée dans la même région, ces auteurs ont montré également une haute fréquence de détection du boscalide dans 35 % des bourdons sauvages, à des concentrations allant jusqu’à 54,5 ng/g et une variabilité de la contamination en fonction des espèces de bourdons et en fonction de la saison (Botias et coll., 2017). Il est à noter que bien que le niveau de contamination soit globalement plus élevé dans les zones arables (jusqu’à 31,7 ng/g de poids corporel), le boscalide est aussi détecté dans des bourdons collectés en zone urbaine (jusqu’à 54 ng/g de poids corporel). Enfin, une exposition de larves à la Pristine (une formulation contenant du boscalide) affecte leur survie à l’âge adulte, avec un effet significativement potentialisé en mélange avec d’autres résidus d’insecticides à faible dose (Wade et coll., 2019).

Un test de toxicité chronique des produits chimiques chez l’abeille est défini dans les lignes directrices de l’OCDE. Ce test (OCDE essai n^o 245), utilisé pour générer des données à des fins réglementaires, implique l’exposition des ouvrières adultes à une substance chimique (par exemple un pesticide) par voie orale pendant une période de 10 jours au cours de laquelle la mortalité et les anomalies de comportement sont mesurées quotidiennement. En 2018, Simon-Delso et coll. ont montré que la mortalité des abeilles exposées au boscalide est faible avant 10 jours d’exposition (Simon-Delso et coll., 2018). Le temps létal 50 % (TL₅₀ ; temps d’exposition pour lequel la mortalité de la population d’abeilles est de 50 % à une concentration de substance active donnée) est de 25 jours pour la concentration de boscalide la plus faible testée (1,125 mg/l). De plus, la concentration létale 50 % (CL₅₀ ; concentration de substance active pour laquelle 50 % de la population d’abeilles est morte après une période d’exposition donnée) est dix fois plus élevée à 8 jours qu’à 25 jours (respectivement 14,7 et 1,17 mg/l). Ces observations, qui méritent d’être reproduites, soulignent le fait que les approches « exposition jusqu’à la mort » sont plus pertinentes que les approches « exposition à durée fixe », en particulier pour les doses d’exposition faibles (Simon-Delso et coll., 2018).

L’exposition des abeilles au boscalide peut également altérer certaines fonctions physiologiques. Ainsi, il a été démontré que des abeilles nourries avec du pollen dont les cultures ont été traitées à la Pristine digéraient moins le pollen et présentaient une plus forte charge virale, et une baisse des concentrations en ATP, évoquant une dérégulation métabolique possiblement liée à une malnutrition (DeGrandi-Hoffman et coll., 2015 ; Campbell et coll., 2016). Il est important de noter que de tels symptômes rendent les abeilles vulnérables à d’autres stresseurs environnementaux, comme les parasites (Nosema ceranae) et les pathogènes. Ainsi, associé à N. ceranae, le boscalide impacte la composition du microbiote intestinal des abeilles (alpha-protéobactéries et gamma-protéobactéries) dont l’importance dans la régulation de la fonction du système nerveux est de plus en plus soulignée (Paris et coll., 2020). À titre d’exemple, une étude récente démontre que le boscalide réduit la fréquence de battement d’ailes des butineuses pendant le vol, sans modifier toutefois la durée du vol, ainsi que l’efficacité des butineuses au niveau de la colonie (Liao et coll., 2019). De plus, la Pristine modifie le comportement relatif à la reconnaissance du nid chez les abeilles solitaires (Artz et Pitts-Singer, 2015).

SDHi et écosystèmes aquatiques

Les effets délétères des pesticides sur les organismes aquatiques et plus particulièrement les poissons, sont aujourd’hui de plus en plus documentés (Bony et coll., 2008 ; Gandar et coll., 2017). En plus de constituer un modèle de choix pour les études de toxicologie (voir ci-dessus), les poissons sont des indicateurs sensibles de la qualité des écosystèmes aquatiques.

Chez l’amphibien Xenopus tropicalis, l’exposition au bixafène ou à l’iso-pyrazam à des concentrations ≥ 1 mg/l conduit à des effets tératogènes avec des microcéphalies, des défauts de mise en place des somites et des hypo-pigmentations (Wu et coll., 2018). De nombreux fongicides SDHi sont commercialisés sous forme de formulations contenant, outre la ou les substances actives, d’autres composés (tensioactifs, solvants, stabilisants, antimoussants, conservateurs...) qui peuvent posséder leur propre toxicité et/ou interférer avec les substances actives. Ces formulations peuvent contenir plus d’une substance active SDHi, ou un SDHi avec un fongicide de la famille des triazoles qui inhibe la synthèse des stérols. D’autres contiennent des fongicides de la famille des strobilurines (pyraclostrobine, dimoxystrobine, fluoxastrobine, krésoxime-méthyle) qui inhibent la respiration cellulaire en agissant sur le complexe III de la chaîne respiratoire et qui pourraient donc potentialiser les effets des SDHi sur la fonction mitochondriale. En effet, l’exposition des embryons de xénope à un mélange de deux SDHi (bixafène et l’isopyrazam) ou d’un SDHi et une strobilurine entraîne des effets toxiques synergiques (Wu et coll., 2018). Cela souligne l’importance de tester non seulement les substances actives mais aussi les formulations dans des études de toxicologie.

Parmi les espèces aquatiques, on peut également citer les micro-algues comme Chlorella vulgaris dont la photosynthèse et la croissance sont altérées par la présence du boscalide dans l’eau (1,6 mg/l) (Qian et coll., 2018b).

Enfin, les fongicides pourraient également avoir un effet négatif sur les écosystèmes d’eau douce en altérant la décomposition des feuilles mortes réalisée par des champignons aquatiques (présents dans les ruisseaux par exemple), ce qui réduirait la formation d’un substrat nutritif essentiel pour la flore microbienne et les amphipodes (crustacés). En effet, Elskus et coll. ont montré que la Pristine (contenant le boscalide) entraîne une baisse de la croissance microbienne et par conséquence de la biomasse des amphipodes (Elskus et coll., 2016).

SDHi et écosystèmes du sol

Certains SDHi sont vendus pour leurs propriétés nématicides, par exemple sous la formulation Indemnify, utilisé pour les gazons, terrains de football ou de golf. Le fluopyram qu’il contient affecte la viabilité des nématodes ainsi que leur comportement d’attraction pour les racines (Oka et Saroya, 2019). Mais, ils présentent aussi l’inconvénient de détruire de nombreux organismes vivants utiles. En effet, les travaux récemment publiés par Bénit et coll. montrent que les principaux SDHi bloquent la SDH du ver de terre (Bénit et coll., 2019). Le fluopyram et la carboxine sont fortement toxiques pour le ver de terre Eisenia andrei, avec un blocage des mécanismes de détoxication qui concourt à la rétention de ces pesticides dans les organismes (Velki et coll., 2019). Le thifluzamide inhibe la croissance et la reproduction des vers à des doses de 10 mg/kg de sol après 28 jours. Cela est associé à un blocage de la SDH dès 1 mg/kg de sol (Yao et coll., 2020). Des études sur le polychète estuarien Simplisetia aequisetis en Australie montrent que des doses sub-létales de boscalide modifient précocement (48 h) le métabolome du ver, avec une forte altération du cycle de Krebs, et des voies de détoxication impliquées dans la synthèse de glutathion, probablement mobilisées pour éliminer le boscalide. Cela se traduit ensuite au niveau physiologique par une baisse de réserves énergétiques lipidiques et une augmentation de la mortalité après 336 h d’exposition (Sinclair et coll., 2019). Par ailleurs, la carboxine associée au thirame, un fongicide non-SDHi, à des doses supérieures à 50 mg/kg de sol inhibe la reproduction et modifie le comportement d’évitement du ver E. andrei (Alves et coll., 2013).

Données épidémiologiques : exposition aux SDHi
et survenue de pathologies

L’ensemble de ces recherches n’a pas permis d’identifier d’étude épidémiologique ayant analysé de manière spécifique le lien entre l’exposition à un fongicide SDHi et un évènement de santé, à l’exception de celle publiée par Béranger et coll. (2020). Cette étude réalisée au sein de la cohorte ELFE en France a révélé la présence de boscalide dans les cheveux des mères (195 échantillons positifs pour la présence de boscalide sur 311 échantillons de cheveux de mères testés) mais n’a pas montré d’association entre l’exposition maternelle au boscalide (estimée par la mesure de sa concentration dans les cheveux, médiane des concentrations mesurées de 0,55 pg/mg de cheveu) et les paramètres anthropométriques des enfants à la naissance (poids, taille et périmètre crânien), suggérant l’absence d’association de l’exposition au boscalide pendant la grossesse sur la croissance intra-utérine.

Exposition potentielle au flutolanil lors de la culture de pommes de terre

Il n’a pas été identifié d’étude portant sur la santé des personnes réalisant le traitement des tubercules de pommes de terre, potentiellement exposées au flutolanil. De manière plus large, peu d’études ont exploré spécifiquement la santé des cultivateurs de pommes de terre, dont certains auraient pu réaliser ces traitements et/ou être au contact de la substance par manipulation de tubercules traités. Au sein de la cohorte AGRICAN, des analyses ont été menées selon le type de cultures produites par les agriculteurs pour les cancers de la prostate, du poumon, de la vessie, du cerveau, les lymphomes malins non hodgkiniens et les myélomes multiples, et pour les sarcomes des tissus mous. Pour le cancer de la prostate, une élévation de risque était observée chez les cultivateurs de pommes de terre qui avaient été exposés aux pesticides (OR = 1,21 ; IC 95 % [1,02-1,44]) (Lemarchand et coll., 2016). De même, pour les tumeurs cérébrales, les cultivateurs de pommes de terre présentaient une élévation de risque, plus marquée chez ceux qui utilisaient des pesticides (HR = 2,11 ; IC 95 % [1,19-3,75]) et ceux qui traitaient les semences/plants (HR = 2,84 ; IC 95 % [1,34-6,03]) (Piel et coll., 2017). Cependant, il n’a pas été mené d’analyse spécifiquement sur le flutolanil, et diverses autres molécules ont été utilisées pour ces traitements.

Exposition potentielle au boscalide

Exposition potentielle à la carboxine par le traitement de semences

Pour les traitements de semences, qui ont pu être réalisés avec la carboxine à partir de 1968, il n’a pas été identifié d’étude portant spécifiquement sur la santé des personnes exposées à cette substance. Il est à noter que le traitement de semences par la carboxine a été autorisé pour un nombre assez important de cultures, en particulier pour diverses céréales mais aussi le maïs, le soja et les pois. Cependant, de nombreuses autres substances ont été utilisées pour le traitement des semences, et la carboxine elle-même n’était plus utilisée seule dès les années 1970. Elle était toujours associée à d’autres molécules entrant dans la composition des produits de traitement de semences comme le cuivre, le lindane, l’anthraquinone, le thirame, le captane... Ces différents éléments rendent complexes l’étude des effets potentiels spécifiques de la carboxine dans les populations humaines, même à partir d’indicateurs indirects. De manière plus large, alors que de nombreuses études ont porté sur l’impact des traitements de semences (comme les néonicotinoïdes) sur les insectes pollinisateurs, il n’existe que peu d’études sur la santé des agriculteurs réalisant eux-mêmes le traitement de leurs semences ou manipulant des semences traitées avant leur achat. Dans la cohorte AGRICAN, la réalisation de traitements de semences faisait l’objet de questions auprès des participants dans le questionnaire d’inclusion. Une élévation modérée du risque a été observée entre le traitement des semences de céréales et le cancer de la prostate (HR = 1,16 ; IC 95 % [1,01-1,34]) (Lemarchand et coll., 2016). Une augmentation de risque, non statistiquement significative, a également été retrouvée pour le traitement des semences et le cancer de la vessie (HR = 1,24 ; IC 95 % [0,77-1,99]) (Boulanger et coll., 2017). Il n’est pas possible de déterminer le rôle spécifique de la carboxine dans ces élévations de risque.

Conclusion

Concernant les tests réglementaires, des réflexions sont en cours au sein de l’OCDE sur l’évaluation du potentiel cancérogène des substances non reconnues comme étant génotoxiques (Jacobs et coll., 2020) telles que les SDHi. Le groupe d’experts international de l’OCDE a reconnu dans cette déclaration de consensus le besoin d’élargir l’évaluation avec des essais in vitro/ex vivo, selon une approche intégrative basée sur le concept des voies d’effets indésirables (adverse outcome pathway), qui consiste à décrire une séquence logique d’évènements liés de façon causale à différents niveaux d’organisation biologique. Certains mécanismes identifiés par l’OCDE sont pertinents pour les SDHi, dont le stress oxydant et l’épigénotoxicité, alors que d’autres mécanismes d’intérêt qui n’ont pas été retenus, pourraient inclure notamment la mitotoxicité et la transition épithélio-mésenchymateuse. Les tests visant à établir le caractère cancérogène ou non d’une substance pourraient également intégrer la notion d’impact sur la progression tumorale (promotion/métastase), le processus d’initiation criblé notamment par les tests de génotoxicité et de mutagénicité n’étant pas le seul impliqué dans la cancérogenèse. Cependant, faire des recommandations précises sur l’amélioration des essais et des modèles en toxicologie réglementaire nécessiterait d’analyser l’ensemble des processus et des essais utilisés, ce qui dépasse largement le cadre de cette expertise.

Addenda

Mitochondrie et chaîne respiratoire

L’organisation structurale de la mitochondrie est représentée dans la figure A20.1. Elle comporte deux compartiments séparés par une membrane externe et une membrane interne : la matrice et l’espace intermembranaire. La membrane interne forme des invaginations qui apparaissent sous forme de crêtes ou replis qui augmentent la surface de la membrane et dont le nombre varie selon l’activité mitochondriale (respiration cellulaire, oxydation des acides gras...). Les complexes de la chaîne respiratoire sont situés au niveau de ces crêtes.

Figure A20.1 Représentation schématique de l’organisation structurale de la mitochondrie*

Figure A20.1

Figure A20.1 Représentation schématique de l’organisation structurale de la mitochondrie*

* Source : http://biologie-enligne.univ-lille1.fr/biocellulaire/apprendre/chapitre10/ch10_page2.htm [consulté le 2 septembre 2020].

La chaîne respiratoire, localisée dans la membrane interne mitochondriale, est composée d’une centaine d’éléments, protéiques et lipidiques, organisés en 4 complexes (I à IV) (figure A20.2). Elle est couplée avec l’ATP synthase (parfois appelée complexe V), également localisée dans la membrane interne, qui accomplit la phosphorylation oxydative de l’ADP en ATP. La chaîne respiratoire est reliée au cycle de Krebs, qui lui fournit une partie des équivalents réduits (NADH, FADH₂) nécessaire à la synthèse d’ATP. Les électrons provenant du NADH et FADH₂ sont respectivement transmis aux complexes I et II, puis transitent par les complexes III et IV pour être enfin transmis au dioxygène, accepteur final. L’énergie ainsi libérée par le passage des électrons d’un complexe au suivant est utilisée pour pomper des protons (H⁺) par l’intermédiaire des complexes I, III et V, depuis la matrice mitochondriale vers l’espace intermembranaire. Ce mouvement de protons crée un gradient de pH de part et d’autre de la membrane interne mitochondriale (le pH devient plus acide dans l’espace intermembranaire que dans la matrice) et engendre un potentiel de membrane (Δψm) à travers la membrane interne de la mitochondrie dû au déséquilibre de charges positives. La résultante de ces deux forces constitue un gradient électrochimique qui est employé par l’ATP synthase qui catalyse la conversion d’ADP + Pi en ATP.

Figure A20.2 Représentation schématique des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et du système de phosphorylation oxydative (d’après Lemarie et Grimm, 2011)

Figure A20.2

Figure A20.2 Représentation schématique des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et du système de phosphorylation oxydative (d’après Lemarie et Grimm, 2011)

(Figure traduite de l’anglais)

Pathologies liées à un déficit de la chaîne respiratoire

Les maladies mitochondriales, quelles que soient leurs causes, sont toutes des pathologies liées à un déficit de la chaîne respiratoire. Elles ont pour conséquences une déplétion en ATP, une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS pour « reactive oxygen species »), un désordre de l’homéostasie des cations (Fe²⁺, Ca²⁺) et une acidose lactique. Elles peuvent survenir à tout âge de la vie, et toucher tous les organes, isolément ou en association, avec notamment des atteintes cardiaques, musculaires, ophtalmologiques, hématologiques, hépatiques, ou encore rénales. Elles ont des présentations cliniques très variées, allant d’atteintes localisées (cardiomyopathies, surdité, paragangliomes), à des syndromes multi-viscéraux (ataxie de Friedreich ; MELAS : encéphalo-myopathie mitochondriale avec acidose lactique et pseudo-accidents vasculaires cérébraux ; MERRF : épilepsie myoclonique avec fibres rouges déchiquetées ; MNGIE : encéphalopathie gastro-intestinale myoneurogénique ; NARP : ataxie neurogénique avec rétinite pigmentaire) (figure A20.3).

Figure A20.3 Les maladies mitochondriales d’origine génétique peuvent toucher de nombreux organes, seuls ou en association, et donner lieu à des tableaux cliniques très variés (d’après Loublier et coll., 2009)

Figure A20.3

Figure A20.3 Les maladies mitochondriales d’origine génétique peuvent toucher de nombreux organes, seuls ou en association, et donner lieu à des tableaux cliniques très variés (d’après Loublier et coll., 2009)

LHON : neuropathie optique héréditaire de Leber ; MELAS : encéphalomyopathie mitochondriale ; acidose lactique et pseudo-accidents vasculaires cérébraux ; MERRF : épilepsie myoclonique avec fibres rouges déchiquetées ; MNGIE : encéphalopathie gastro-intestinale myo- ou neurogénique ; POIC : pseudo-obstruction intestinale chronique.

Pesticides SDHi non autorisés au niveau européen

Tableau A20.I Les pesticides SDHi non autorisés au niveau européen

Sources : Anses, 2019 ; Pesticide Properties DataBase (https://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/ [consulté le 14 mai 2020]), rapports Efsa et Echa (EU Pesticide Database : https://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-database [consulté le 14 mai 2020]) et les sites des entreprises agrochimiques.

Algorithmes de recherche bibliographique pour identifier des études portant sur les effets sanitaires des fongicides SDHi

SDHi et pesticides (PubMed/Scopus/WoS)

Nom des familles SDHi et pesticides (PubMed/Scopus/WoS)

SDHi et épidémiologie (PubMed)

Nom des familles SDHi et épidémiologie (PubMed)

Nom des substances actives SDHi¹¹⁶ et épidémiologie (PubMed)

SDHi et exposition des agriculteurs (PubMed/Scopus/WoS)

Traitement des semences et épidémiologie (PubMed)

Traitement des semences et exposition des agriculteurs (PubMed)

Exposition des agriculteurs lors du traitement des pommes de terre (PubMed/Scopus/WoS)

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