Comment une cellule répond-elle et s’adapte-t-elle aux fluctuations de son environnement, par exemple, à la disponibilité en nutriments, est une question d’importance fondamentale. Plusieurs voies de signalisation, dont celles impliquant la kinase mTOR (mammalian target of rapamycin), TORC1 (mTOR complex 1) et TORC2, renseignent les cellules sur la quantité et la qualité des sucres, des acides aminés et des composés azotés disponibles. Ces voies contrôlent le taux de croissance et l’induction de programmes développementaux via différents effecteurs, qui modulent les profils transcriptionnels, traductionnels, post-traductionnels et métaboliques des cellules [1, 2].

La régulation de l’expression des gènes joue un rôle fondamental dans ce processus et peut s’effectuer à plusieurs étapes [3]. Une étape critique est l’initiation de la transcription, qui requiert le recrutement séquentiel de nombreux facteurs, dont des complexes co-activateurs. Des études ont caractérisé leur composition et leurs activités, cependant, comment les co-activateurs interprètent-ils les signaux provenant des voies de signalisation reste peu étudié [4].

Schizosaccharomyces pombe est une levure fissipare, unicellulaire, qui prolifère à l’état haploïde en présence de nutriments dans le milieu extérieur. En réponse à une carence, plus particulièrement d’une source d’azote, S. pombe entre soit en quiescence, soit en différenciation sexuelle si un partenaire est présent. S. pombe représente donc un excellent modèle expérimental pour étudier les mécanismes de décision de prolifération en réponse aux nutriments. Contrairement à Saccharomyces cerevisiae, une autre levure modèle, les voies de signalisation mTOR sont parfaitement conservées entre S. pombe et les mammifères (Figure 1A).

Figure 1. Le co-activateur transcriptionnel SAGA fonctionne en aval de TORC1. Le co-activateur transcriptionnel SAGA (Spt-ada-gcn5-acetyl-transferase) régule l’expression des gènes de différenciation en aval de TORC1 (target of rapamycin complex 1) et est phosphorylé en réponse aux nutriments. A. Schéma simplifié de la voie de signalisation TORC1 chez Schizosaccharomyces pombe. En conditions riches en nutriments, la voie TORC1 est active et contribue à l’inhibition de la différenciation. SAGA, via la sous-unité acétyltransférase Gcn5, réprime l’expression des gènes de différenciation, suggérant que TORC1 et SAGA pourraient agir dans la même voie. B, C. Analyse d’épistasie entre Tsc1 (tuberous sclerosis complex 1) /Tsc2 (TORC1) et Gcn5 (SAGA). B. L’expression d’un gène de différenciation est quantifiée par RT-qPCR (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction) à partir d’ARN extraits de souches de différents génotypes, qui ont été cultivées soit en conditions riches (en bleu), ou carencées en nutriments pendant 4 heures (en rouge). C..Le nombre de cellules différenciées dans ces mêmes souches est compté au microscope. Les flèches blanches indiquent des levures en état de différenciation sexuelle. D. Analyse du profil de migration de la sous-unité architecturale Taf12 de SAGA par électrophorèse et immuno-détection d’extraits protéiques de levures cultivées dans les conditions indiquées. La flèche indique l’isoforme phosphorylée de Taf12, dont la migration est retardée.

Figure 1. Le co-activateur transcriptionnel SAGA fonctionne en aval de TORC1. Le co-activateur transcriptionnel SAGA (Spt-ada-gcn5-acetyl-transferase) régule l’expression des gènes de différenciation en aval de TORC1 (target of rapamycin complex 1) et est phosphorylé en réponse aux nutriments. A. Schéma simplifié de la voie de signalisation TORC1 chez Schizosaccharomyces pombe. En conditions riches en nutriments, la voie TORC1 est active et contribue à l’inhibition de la différenciation. SAGA, via la sous-unité acétyltransférase Gcn5, réprime l’expression des gènes de différenciation, suggérant que TORC1 et SAGA pourraient agir dans la même voie. B, C. Analyse d’épistasie entre Tsc1 (tuberous sclerosis complex 1) /Tsc2 (TORC1) et Gcn5 (SAGA). B. L’expression d’un gène de différenciation est quantifiée par RT-qPCR (reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction) à partir d’ARN extraits de souches de différents génotypes, qui ont été cultivées soit en conditions riches (en bleu), ou carencées en nutriments pendant 4 heures (en rouge). C..Le nombre de cellules différenciées dans ces mêmes souches est compté au microscope. Les flèches blanches indiquent des levures en état de différenciation sexuelle. D. Analyse du profil de migration de la sous-unité architecturale Taf12 de SAGA par électrophorèse et immuno-détection d’extraits protéiques de levures cultivées dans les conditions indiquées. La flèche indique l’isoforme phosphorylée de Taf12, dont la migration est retardée.

Plusieurs études ont établi que, chez S. pombe, les voies TORC1 et TORC2 ont des rôles opposés dans le contrôle de l’équilibre entre prolifération et différenciation sexuelle [5]. TORC1 stimule la croissance et inhibe la différenciation sexuelle en conditions riches, alors que TORC2 induit l’entrée en différenciation en réponse à une carence. De la même manière, des travaux de notre laboratoire ont montré que le complexe co-activateur transcriptionnel SAGA (Spt-ada-gcn5-acetyl-transferase) est capable soit de réprimer soit d’induire l’expression des gènes de différenciation sexuelle, en fonction de la disponibilité en nutriments [6].

Ces observations soulevaient deux questions. Tout d’abord, quel mécanisme explique-t-il les fonctions antagonistes de TORC1 et TORC2 sur l’équilibre entre prolifération et différenciation ? Et comment un co-activateur transcriptionnel comme SAGA peut-il détecter un changement du niveau de nutriment et ainsi réprimer ou activer la transcription de gènes cibles ? Nous avons combiné des approches de génétique, de biochimie et de protéomique quantitative pour répondre à ces questions. Nos travaux montrent que les voies de signalisation TORC1 et TORC2 modulent le niveau de phosphorylation de la sous-unité Taf12 (TATA-Box-binding protein-associated factor 12) du complexe SAGA, afin de coordonner l’entrée en différenciation sexuelle avec la disponibilité en nutriments [7].

Nous avons tout d’abord réalisé des analyses d’interactions génétiques chez S. pombe. En conditions de prolifération, riches en nutriments, TORC1 et la sous-unité acétyltransférase de SAGA, Gcn5, inhibent l’expression des gènes de différenciation. Ainsi, lorsque la voie TORC1 est suractivée, par exemple en activant la GTPase Rheb (GTP-binding protein, Ras homolog enriched in brain) dans les mutants tsc1∆^1, ou tsc2∆, S. pombe est incapable d’induire la différenciation en réponse à une carence (Figure 1 B-C). Les mutants gcn5∆ présentent, eux, le phénotype opposé et entrent en différenciation même en présence de nutriments (Figure 1 B-C). Les doubles mutants (gcn5∆ tsc1∆ et gcn5∆ tsc2∆) ont un phénotype identique aux simples mutants gcn5∆, c’est-à-dire une différenciation sexuelle constitutive (Figure 1 B-C). La mutation gcn5∆ est épistatique² sur des mutations ponctuelles qui augmentent directement l’activité catalytique de TORC1. L’absence de Gcn5 supprime donc le phénotype causé par la suractivation de TORC1, démontrant que Gcn5 régule l’expression des gènes de différenciation en aval de TORC1.

En utilisant la même stratégie d’analyse du phénotype des doubles mutants, nous avons observé que SAGA contrôle la différenciation sexuelle en aval de la voie TORC2. Ces interactions génétiques sont spécifiques des voies TORC1 et TORC2. En effet, nous n’avons détecté aucune interaction fonctionnelle entre SAGA et les kinases Pka1^PKA, Sty1^p38 (mitogenic-activated protein kinase-P38) ou Ssp2^AMPK (AMPKα) qui, chez S. pombe, contribuent également au contrôle de l’équilibre entre prolifération et différenciation en réponse aux nutriments.

Des approches de biochimie et de phospho-protéomique ont par la suite permis de comprendre comment TORC1 et TORC2 contrôlaient SAGA. Pour cela, nous avons analysé le complexe SAGA par spectrométrie de masse quantitative, grâce au marquage métabolique de S. pombe par des isotopes lourds d’acides aminés (SILAC). L’analyse de ses sous-unités a indiqué que la composition de SAGA est identique dans les cellules en prolifération ou en différenciation. En revanche, l’analyse des peptides phosphorylés a révélé des différences. En effet, une sous-unité architecturale de SAGA, Taf12, est plus fortement phosphorylée au sein de complexes SAGA purifiés à partir de cellules carencées, en comparaison aux conditions riches. Nous avons constaté que Gcn5 n’est pas différentiellement phosphorylée dans ces conditions.

Plusieurs expériences ont confirmé que Taf12 est phosphorylée à la suite d’une carence nutritionnelle. Tout d’abord, nous pouvons détecter une isoforme de Taf12 spécifiquement dans des extraits protéiques de cellules carencées (Figure 1D). Des tests supplémentaires ont confirmé que cet isoforme correspond à des phosphorylations de Taf12, sur plusieurs résidus. De plus, Taf12 est très rapidement phosphorylée, environ trente minutes après la disparition des nutriments du milieu, comme la déplétion d’une source d’azote (Figure 1D). Cette modification est dynamique, car Taf12 est rapidement dé-phosphorylée si on rajoute des nutriments à des cellules carencées. Enfin, la substitution des acides aminés correspondants en résidus soit non phosphorylables, soit mimant la charge négative de la phosphorylation, perturbe l’entrée en différenciation sexuelle. En conclusion, la cinétique, la réversibilité et l’importance physiologique de la phosphorylation de Taf12 suggèrent que des voies de signalisation qui répondent à la disponibilité en azote contrôlent directement cette modification.

Nos résultats de génétique et de biochimie étaient cependant contradictoires. En effet, la génétique démontrait que TORC1 régulait SAGA, directement ou indirectement. Pourtant, lorsque S. pombe était carencée, l’activité de TORC1 diminuait rapidement [8,9], alors que la phosphorylation de SAGA augmentait concomitamment (Figure 1D).

Pour résoudre ce paradoxe apparent, nous avons formulé l’hypothèse que TORC1 active une phosphatase qui dé-phosphoryle la sous-unité Taf12 de SAGA. En effet, chez la levure S. cerevisiae, la protéine phosphatase PP2A est un effecteur connu de TORC1. Des approches génétiques ont démontré que, chez S. pombe, TORC1 active la phosphatase PP2A et que celle-ci fonctionne en amont de SAGA. Des expériences réalisées in vitro et in vivo ont permis d’établir que PP2A est directement responsable de la déphosphorylation de Taf12 en conditions riches en nutriments. Nous avons aussi montré que TORC1 régule PP2A indirectement, en inhibant la kinase Ppk18^Greatwall. En réponse à une carence, l’activité de TORC1 diminue, permettant l’activation de Ppk18^Greatwall, qui phosphoryle l’endosulfine Igo1³. La forme phosphorylée d’Igo1 inhibe alors l’activité phosphatase du complexe PP2A et empêche la déphosphorylation de Taf12. Nous n’avons cependant pas pu déterminer par quel mécanisme TORC1 inhibe la kinase Ppk18^Greatwall en conditions de prolifération.

Le niveau de phosphorylation de Taf12 est la résultante de l’action de la phosphatase PP2A et d’une kinase. Nous avons donc testé le rôle de toutes les kinases impliquées dans la signalisation en réponse à une carence nutritionnelle chez S. pombe. Cette approche candidate a permis l’identification de TORC2 et de sa cible canonique, la kinase Gad8^AKT. La voie TORC2-Gad8^AKT contribue en effet à la phosphorylation de Taf12 in vitro et in vivo, en accord avec l’interaction génétique que nous avions observée entre TORC2 et SAGA.

En conclusion, la sous-unité Taf12 du complexe SAGA subit une phosphorylation rapide et dynamique en réponse à la disponibilité en nutriments, qui résulte des activités antagonistes de deux voies de signalisation. En présence de nutriments, TORC1 active la phosphatase PP2A, qui dé-phosphoryle Taf12. Une carence nutritionnelle inhibe inversement TORC1 et PP2A, via la kinase Ppk18^Greatwall. En parallèle, la voie TORC2-Gad8^AKT activée contribue à la phosphorylation de Taf12, et module la sortie du cycle cellulaire et l’entrée en différenciation sexuelle (Figure 2).

Figure 2. Rôle du co-activateur SAGA sur l’équilibre entre prolifération et différenciation sexuelle. Le co-activateur SAGA (Spt-ada-gcn5-acetyl-transferase) contrôle l’équilibre entre prolifération et différenciation sexuelle en aval des voies TORC1 (target of rapamycin complex 1) et TORC2, via la phosphorylation de sa sous-unité architecturale Taf12. En présence de nutriments, TORC1 active la phosphatase PP2A, qui dé-phosphoryle Taf12. Sans nutriments, la voie TORC1-PP2A est inhibée alors que la voie TORC2-Gad8AKT est activée. La kinase Gad8AKT phosphoryle alors Taf12 et induit l’entrée en différenciation (diff) sexuelle.

Figure 2. Rôle du co-activateur SAGA sur l’équilibre entre prolifération et différenciation sexuelle. Le co-activateur SAGA (Spt-ada-gcn5-acetyl-transferase) contrôle l’équilibre entre prolifération et différenciation sexuelle en aval des voies TORC1 (target of rapamycin complex 1) et TORC2, via la phosphorylation de sa sous-unité architecturale Taf12. En présence de nutriments, TORC1 active la phosphatase PP2A, qui dé-phosphoryle Taf12. Sans nutriments, la voie TORC1-PP2A est inhibée alors que la voie TORC2-Gad8AKT est activée. La kinase Gad8AKT phosphoryle alors Taf12 et induit l’entrée en différenciation (diff) sexuelle.

Les activités régulatrices de SAGA sur les gènes inductibles sont bien caractérisées. Par contre, comment SAGA répond aux fluctuations de l’environnement et aux voies de signalisation restait une question ouverte, à laquelle nos travaux apportent un élément de réponse. Chez S. pombe, SAGA est en effet une cible directe de voies de signalisation qui répondent à la disponibilité en nutriments. SAGA est donc un nouvel effecteur de ces kinases dans la régulation de l’expression des gènes contrôlant l’équilibre entre prolifération et différenciation. De plus, ces résultats révèlent un mécanisme nouveau de contrôle de la transcription par les voies de signalisation TORC1 et TORC2, qui convergent vers un effecteur commun. En perspective, il sera important d’étudier l’effet de la phosphorylation de Taf12 sur les fonctions du complexe SAGA, et notamment de Gcn5, afin d’identifier le mécanisme complet de la réponse de SAGA aux voies de signalisation sensibles aux nutriments.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

Thomas Laboucarié a bénéficié des financements suivants : Labex EpiGenMed, Investissements d’avenir (ANR-10-LABX-12-01) et Fondation ARC pour la recherche contre le cancer. Dominique Helmlinger est financé via un programme ATIP-Avenir du CNRS, FP7 Marie Curie Actions (FP7-PEOPLE-2012-CIG/COACTIVATOR), la fondation ARC (PJA-20131200471), l’agence nationale de la recherche (ANR-15-CE12-0009-01).