Malgré des besoins importants, notre arsenal thérapeutique contre les infections virales, et notamment contre les virus à génome ARN, est extrêmement limité [1]. Si des vaccins efficaces ont été développés contre de nombreux virus mortels pour l’homme comme la variole, la fièvre jaune ou la poliomyélite, la couverture vaccinale reste bien souvent insuffisante, y compris dans les pays développés. À titre d’exemple, on assiste en France depuis quelques années à une recrudescence des cas de rougeole avec des conséquences parfois dramatiques, alors qu’un vaccin sûr et efficace existe [2]. Des molécules antivirales seraient ainsi d’une grande utilité pour traiter des patients ayant déjà déclaré l’infection. En outre, il n’existe pas de vaccin contre de nombreux virus qui représentent pourtant un problème majeur en santé publique. Par exemple, le virus respiratoire syncytial humain (HRSV) serait responsable à l’échelle mondiale d’environ 3,4 millions d’infections respiratoires sévères et d’au moins 66 000 décès chez les enfants de moins de cinq ans [3]. Du fait de la multiplication des échanges internationaux, les grandes métropoles se trouvent également de plus en plus exposées à des infections tropicales d’origine virale, comme la dengue ou le chikungunya. Enfin, on assiste depuis quelques décennies à des phénomènes d’émergence virale liés à l’anthropisation des espaces naturels, qui facilitent la transmission des virus animaux à l’homme. L’épidémie de MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus) est ainsi un exemple récent d’émergence virale [4].

Pour mettre au point une molécule antivirale, l’approche classique consiste à cibler l’activité d’une protéine virale essentielle au cycle du virus : ARN polymérase, intégrase, hélicase ou protéase par exemple. Au milieu des années 1990, les associations d’antirétroviraux hautement actifs ont ainsi permis des avancées importantes dans la prise en charge des patients infectés par le VIH (virus de l’immunodéficience humaine), même s’il n’est pas encore possible d’éliminer définitivement le virus [5]. De même, des résultats révolutionnaires ont été obtenus récemment dans le traitement de l’hépatite C grâce aux dernières générations d’antiviraux à action directe, qui ciblent notamment la protéase NS3-4A et la polymérase NS5B du virus de l’hépatite C (VHC) [6, 7]. Cependant, la très grande diversité des virus responsables d’infections chez l’homme ne permet pas d’envisager le développement pour chacun d’un traitement spécifique, d’où l’idée de développer des molécules à large spectre, actives contre différents virus [1]. Certaines fonctions enzymatiques – ARN polymérase, hélicase, protéase – sont suffisamment conservées entre protéines virales pour qu’il soit possible de développer de telles molécules. Récemment, un nouvel analogue de nucléoside capable d’inhiber de nombreux virus à ARN, et notamment les filovirus tels que le virus de Marburg, a été décrit et semble particulièrement efficace in vivo contre ces infections [8]. Cependant, le nombre de facteurs viraux et/ou d’activités enzymatiques ainsi conservés et qui peuvent être la cible de molécules thérapeutiques est relativement limité. Par ailleurs, la grande plasticité des génomes viraux facilite l’apparition rapide de mutants d’échappement qui rendent parfois inefficaces ce type de traitements, comme le montre l’évolution du virus de la grippe [9]. Afin de contourner ces deux obstacles, plusieurs équipes dont la nôtre cherchent à cibler la cellule hôte plutôt que le virus lui-même en bloquant des mécanismes cellulaires essentiels à la réplication virale, ou en stimulant la réponse immunitaire innée [10, 11].

Pour identifier des molécules ayant une activité biologique d’intérêt dans le traitement des infections microbiennes, nous avons mis en place à l’Institut Pasteur de Paris la plate-forme CBC (criblage biologique et chimiothèques). Celle-ci dispose de différents équipements permettant le criblage de composés à haut débit (Figure 1) et de plusieurs chimiothèques commerciales et académiques pour un total d’environ 57 000 molécules (Tableau I). Pour isoler des composés antiviraux à large spectre à partir de ces banques, nous avons élaboré deux stratégies distinctes. Tout d’abord, nous avons développé un protocole de criblage en culture cellulaire basé sur l’utilisation de souches recombinantes des virus de la rougeole et du chikungunya, qui expriment la luciférase comme rapporteur de la réplication virale [12]. Ces deux virus étant très différents, aussi bien en termes de structure que de stratégie de réplication, nous avons montré qu’il était possible d’isoler, grâce à ce protocole, des composés ayant une activité antivirale à large spectre. Par ailleurs, plusieurs de ces molécules présentent une activité antivirale variable en fonction du type cellulaire considéré, ce qui suggère que leur cible est un facteur de la cellule hôte plutôt que la machinerie de réplication virale. Nous cherchons actuellement à déterminer leur mode d’action.

Figure 1. Descriptif de la plate-forme CBC. La plate-forme CBC a pour objectif la découverte de nouveaux outils moléculaires permettant d’étudier des structures ou des processus biologiques complexes, ou l’identification de composés à visée thérapeutique, principalement dans le domaine des anti-infectieux. Elle est opérationnelle depuis 2008 et fait partie du GDR ChemBioScreen depuis la création de ce dernier en 2011. Deux stations Freedom EVO® (TECAN) constituent le cœur du dispositif. Elles sont placées sous des plafonds soufflants permettant de travailler en conditions stériles et sont situées dans un laboratoire de niveau de confinement 2. Chaque station contient un carrousel (température ambiante) et un incubateur (Cytomat, température régulée) où sont stockés les consommables (plaques 96 ou 384-puits et boîtes de cônes), un bras manipulateur qui va déplacer les consommables sur l’ensemble du plan de travail, deux systèmes de pipetage (96 canaux et 4 ou 8 aiguilles) permettant de réaliser des pipetages entre 1 et 250 µl, et un lecteur de codes à barres permettant une gestion automatisée des plaques qui entrent sur le plan de travail. Selon les applications, des cônes stériles ou des aiguilles téflonisées peuvent être utilisés pour les pipetages. L’une des stations (Freedom EVO® 150, panneau inférieur) intègre un laveur de plaques spécialement adapté aux tests ELISA et aux cultures cellulaires. Sur la plus grande des deux stations (Freedom EVO® 200, panneau supérieur) sont intégrés deux blocs Peltier agitateurs (température réglable entre 4 et 40°C) et des lecteurs multimodes de plaques permettant des mesures en absorbance, fluorescence et luminescence, ainsi que l’utilisation de la technologie AlphaScreen (Sunrise ou Infinite M200 Pro, et Infinite M1000, TECAN). Les deux stations sont pilotées par le logiciel Freedom EVOware (TECAN). Par ailleurs, les données de pipetage et de lecture sont envoyées à un serveur qui héberge un LIMS développé à façon par la société Modul-Bio, et qui permet le stockage et l’analyse de ces données ainsi que la gestion des chimiothèques.

Figure 1. Descriptif de la plate-forme CBC. La plate-forme CBC a pour objectif la découverte de nouveaux outils moléculaires permettant d’étudier des structures ou des processus biologiques complexes, ou l’identification de composés à visée thérapeutique, principalement dans le domaine des anti-infectieux. Elle est opérationnelle depuis 2008 et fait partie du GDR ChemBioScreen depuis la création de ce dernier en 2011. Deux stations Freedom EVO® (TECAN) constituent le cœur du dispositif. Elles sont placées sous des plafonds soufflants permettant de travailler en conditions stériles et sont situées dans un laboratoire de niveau de confinement 2. Chaque station contient un carrousel (température ambiante) et un incubateur (Cytomat, température régulée) où sont stockés les consommables (plaques 96 ou 384-puits et boîtes de cônes), un bras manipulateur qui va déplacer les consommables sur l’ensemble du plan de travail, deux systèmes de pipetage (96 canaux et 4 ou 8 aiguilles) permettant de réaliser des pipetages entre 1 et 250 µl, et un lecteur de codes à barres permettant une gestion automatisée des plaques qui entrent sur le plan de travail. Selon les applications, des cônes stériles ou des aiguilles téflonisées peuvent être utilisés pour les pipetages. L’une des stations (Freedom EVO® 150, panneau inférieur) intègre un laveur de plaques spécialement adapté aux tests ELISA et aux cultures cellulaires. Sur la plus grande des deux stations (Freedom EVO® 200, panneau supérieur) sont intégrés deux blocs Peltier agitateurs (température réglable entre 4 et 40°C) et des lecteurs multimodes de plaques permettant des mesures en absorbance, fluorescence et luminescence, ainsi que l’utilisation de la technologie AlphaScreen (Sunrise ou Infinite M200 Pro, et Infinite M1000, TECAN). Les deux stations sont pilotées par le logiciel Freedom EVOware (TECAN). Par ailleurs, les données de pipetage et de lecture sont envoyées à un serveur qui héberge un LIMS développé à façon par la société Modul-Bio, et qui permet le stockage et l’analyse de ces données ainsi que la gestion des chimiothèques.

Stimuler la réponse immunitaire innée des cellules

Parallèlement à ce travail, nous avons développé un test phénotypique permettant de sélectionner des composés capables de stimuler la réponse immunitaire innée antivirale des cellules humaines, et notamment l’expression des gènes induits par les interférons de type I (IFN-α/β) ou ISG (interferon-stimulated genes). Ces gènes codent plusieurs facteurs qui vont inhiber des étapes différentes du cycle viral, et permettre ainsi l’établissement d’un état de résistance aux infections virales [13]. Leur synthèse est déclenchée par la reconnaissance de motifs moléculaires associés aux organismes pathogènes (ou PAMP, pour pathogen-associated molecular patterns) par des récepteurs cellulaires appelés PRR (pattern recognition receptors) [14]. La détection de l’agent pathogène déclenche ensuite une cascade de signalisation entraînant notamment l’activation des facteurs de transcription IRF3 et 7 (interferon regulatory factor-3/7), tous deux impliqués dans l’activation directe de certains ISG et dans l’induction des IFN-α/β. Comme la plupart des cytokines, les IFN-α/β exercent une action paracrine sur les cellules voisines et une action autocrine sur la cellule productrice elle-même. La fixation des IFN de type I sur leur récepteur IFNAR entraîne l’activation du facteur de transcription ISGF3 formé de STAT1, STAT2 et IRF9, et l’induction des ISG. L’élément de réponse à ISGF3 présent dans le promoteur des ISG est connu sous le nom d’ISRE (interferon-stimulated response element). Pour identifier de petites molécules capables de stimuler l’expression des ISG, nous avons utilisé des cellules humaines transfectées par un gène rapporteur exprimant la luciférase sous contrôle de l’élément de réponse ISRE (lignée cellulaire STING-37) (Figure 2) [15]. D’autres équipes ont développé une stratégie similaire [16–18]. Ainsi, l’induction de ce gène rapporteur par un composé se traduit par une augmentation de l’activité luciférase. En utilisant ce test, nous avons réalisé une campagne de criblage de la banque de molécules disponible sur la plateforme CBC. Nous avons identifié ainsi plusieurs inducteurs du gène rapporteur ISRE-luc, et ces composés ont ensuite été testés pour leur capacité à inhiber la réplication de différents virus, afin d’évaluer leur activité antivirale. Parmi ces molécules, le composé DD264 (Figure 3), issu de la chimiothèque de l’Institut Curie, a fait l’objet d’une étude détaillée [15]. Ce composé est un faible inducteur du gène rapporteur ISRE-luc, et donc a priori un mauvais stimulateur des ISG et de la réponse cellulaire innée antivirale. Pourtant, nous avons constaté qu’in vitro, la molécule DD264 inhibe très efficacement la réplication de différents virus à génome ARN de polarité positive (virus du chikungunya, virus du Nil occidental, virus de la dengue, coronavirus 229E, coxsackievirus B3) ou négative (virus de la rougeole, virus respiratoire syncytial, virus parainfluenza de type 3). L’activité originale de ce composé nous a conduits à étudier son mécanisme d’action et à rechercher sa cible.

Figure 2. Schéma des différentes étapes du test phénotypique miniaturisé mis au point pour l’identification de composés capables de stimuler la réponse immunitaire innée antivirale. La première étape consiste en un dépôt des composés des chimiothèques disponibles (Tableau I) dans des plaques 96 puits (un composé par puits dans du DMSO). Les colonnes 1 et 12 sont dédiées aux contrôles (négatifs en présence de DMSO seul et positifs en présence d’IFN-b) : les valeurs obtenues pour ces contrôles serviront à calculer le facteur Z’ [27], qui rend compte de la qualité et de la reproductibilité du test sur la base des écart-types et des moyennes des minima (contrôles négatifs) et des maxima (contrôles positifs). Puis, des cellules transfectées de façon stable avec un plasmide portant la construction ISRE-luc (lignée cellulaire STING-37) sont ajoutées dans les puits des plaques (100 µl par puits). Après 24 h d’incubation à 37 °C en présence de 5 % de CO2, le substrat de la luciférase est ajouté dans chaque puits (50 µL Bright-GloTM luciferase assay system, Promega), et incubé à température ambiante 6 minutes. La mesure de luminescence est ensuite réalisée sur un lecteur de plaques multimode (temps d’intégration de 100 ms).

Figure 2. Schéma des différentes étapes du test phénotypique miniaturisé mis au point pour l’identification de composés capables de stimuler la réponse immunitaire innée antivirale. La première étape consiste en un dépôt des composés des chimiothèques disponibles (Tableau I) dans des plaques 96 puits (un composé par puits dans du DMSO). Les colonnes 1 et 12 sont dédiées aux contrôles (négatifs en présence de DMSO seul et positifs en présence d’IFN-b) : les valeurs obtenues pour ces contrôles serviront à calculer le facteur Z’ [27], qui rend compte de la qualité et de la reproductibilité du test sur la base des écart-types et des moyennes des minima (contrôles négatifs) et des maxima (contrôles positifs). Puis, des cellules transfectées de façon stable avec un plasmide portant la construction ISRE-luc (lignée cellulaire STING-37) sont ajoutées dans les puits des plaques (100 µl par puits). Après 24 h d’incubation à 37 °C en présence de 5 % de CO2, le substrat de la luciférase est ajouté dans chaque puits (50 µL Bright-GloTM luciferase assay system, Promega), et incubé à température ambiante 6 minutes. La mesure de luminescence est ensuite réalisée sur un lecteur de plaques multimode (temps d’intégration de 100 ms).

Figure 3. Représentation partielle de la biosynthèse des pyrimidines. Dans la voie de novo, les trois premières étapes sont réalisées au sein d’un complexe enzymatique multifonctionnel appelé le CAD (carbamyl phosphate synthétase - aspartate transcarbamylase - dihydroorotase) : à partir de glutamine est formé successivement le carbamoyl phosphate, puis le carbamoyl aspartate et enfin le dihydroorotate. La quatrième étape consiste en une déshydrogénation du dihydroorotate pour conduire à la formation d’orotate : l’enzyme responsable de cette réaction est la dihydroorotate déshydrogénase (DHODH). C’est cette enzyme qui est inhibée par le composé DD264. Les deux étapes suivantes de cette biosynthèse conduisent à la formation d’UMP, et sont à nouveau réalisées au sein d’un complexe multifonctionnel chez les mammifères (UMP synthétase). L’UMP sert de base pour l’obtention des autres nucléotides pyrimidiques. La voie de sauvetage est la deuxième source de nucléotides pyrimidiques. Au cours de cette voie, ces derniers sont synthétisés à partir des intermédiaires (les bases puriques et les nucléosides) du catabolisme (dégradation) des nucléotides. L’uracile, puis l’uridine, sont récupérés pour former l’UMP (par l’uridine phosphorylase puis l’uridine kinase).

Figure 3. Représentation partielle de la biosynthèse des pyrimidines. Dans la voie de novo, les trois premières étapes sont réalisées au sein d’un complexe enzymatique multifonctionnel appelé le CAD (carbamyl phosphate synthétase - aspartate transcarbamylase - dihydroorotase) : à partir de glutamine est formé successivement le carbamoyl phosphate, puis le carbamoyl aspartate et enfin le dihydroorotate. La quatrième étape consiste en une déshydrogénation du dihydroorotate pour conduire à la formation d’orotate : l’enzyme responsable de cette réaction est la dihydroorotate déshydrogénase (DHODH). C’est cette enzyme qui est inhibée par le composé DD264. Les deux étapes suivantes de cette biosynthèse conduisent à la formation d’UMP, et sont à nouveau réalisées au sein d’un complexe multifonctionnel chez les mammifères (UMP synthétase). L’UMP sert de base pour l’obtention des autres nucléotides pyrimidiques. La voie de sauvetage est la deuxième source de nucléotides pyrimidiques. Au cours de cette voie, ces derniers sont synthétisés à partir des intermédiaires (les bases puriques et les nucléosides) du catabolisme (dégradation) des nucléotides. L’uracile, puis l’uridine, sont récupérés pour former l’UMP (par l’uridine phosphorylase puis l’uridine kinase).

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.