La cellule est constamment exposée à des stress physiologiques comme le manque de nutriments, les chocs thermiques et les chocs ischémiques. Pour y résister, la cellule doit rapidement répondre en activant des voies de survie. Les agents exogènes, tels que les drogues utilisées en chimiothérapie, provoquent également d’importants stress cellulaires. L’activation des voies de réponse au stress peut alors interférer avec la mort cellulaire, menant à une chimiorésistance. Or, ce problème de chimiorésistance est fréquemment observé en cancérologie.

Les traitements anticancéreux ciblent souvent les voies d’induction de la mort cellulaire par apoptose dans les cellules tumorales. L’instabilité génomique des cellules cancéreuses, source de mutations additionnelles, et les modifications épigénétiques qui aboutissent à une augmentation de la prolifération ou une diminution de l’apoptose cellulaire [ 1], sont des mécanismes clés de la résistance de ces cellules aux drogues génotoxiques. Plusieurs études ont aussi démontré l’intervention, dans la diminution de la sensibilité cellulaire à certaines drogues ou l’échappement des cellules aux contrôles du cycle cellulaire, d’une reprogrammation de certaines voies de signalisation ciblées par ces drogues, même si ces dernières induisaient des dommages à l’ADN [1– 3]. Plus récemment, un mécanisme de résistance à l’apoptose induite par les radiations [ 4] et par les drogues chimiothérapeutiques a été mis en évidence [ 5– 8] ; il implique la formation de granules de stress anti-apoptotiques.

Les granules de stress sont des corps cytoplasmiques non membranaires et dynamiques constitués, entre autres, d’ARNm, de protéines de liaison à l’ARN, et de molécules de signalisation intervenant dans la mort cellulaire. La séquestration des molécules de signalisation telles que RACK1 (receptor for activated C kinase 1), TRAF2 (TNF receptor-associated factor 2), ROCK1 (rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1) et RSK2 (ribosomal protein S6 kinase 2) dans les granules de stress inactive leur fonction dans les voies apoptotiques et le processus de mort cellulaire correspondant. Ceci contribue à la survie des cellules soumises au stress [5, 9, 10]. Les granules de stress peuvent aussi interférer avec l’apoptose via la stabilisation d’ARNm codant pour des protéines intervenant dans la survie cellulaire, telles que les cytokines ou p21 [4, 8]. De plus, en séquestrant les facteurs d’initiation de la traduction, les granules de stress contribuent à la répression de cette dernière. En effet, l’initiation de la traduction est inhibée dans la plupart des conditions induisant ces granules, comme les infections virales, le stress oxydant, les radiations ionisantes, les chocs thermiques et ischémiques, ainsi que les inhibiteurs du protéasome [ 7, 11– 13]. Cette inhibition fait intervenir la phosphorylation du facteur d’initiation de la traduction eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2α) [ 14]. Cette modification prévient la formation du complexe ternaire eIF2-GTP-ARNt fonctionnel, et résulte en la formation de complexes d’initiation incompétents pour la traduction, dont l’accumulation aboutit à la formation de granules de stress (Figure 1) [ 15]. eIF2α est phosphorylée sur la sérine 51 par une kinase, qui diffère selon le type de stress. Ces kinases sont au nombre de quatre [ 16, 17] : la protéine kinase R (PKR) intervient lors d’infections virales, la kinase PERK (PKR-like endoplasmic reticulum kinase) lors d’un stress du réticulum endoplasmique, la protéine kinase GCN2 (general control non-derepressible 2) en réponse aux radiations et à la carence en acides aminés, et, enfin, HRI (heme-regulated inhibitor) dans des conditions de déficit en hème. HRI est également activée lors d’une réponse au stress oxydant et au cours de traitements par des inhibiteurs du protéasome induisant la formation de granules de stress [7, 18]. Dans cette revue, nous proposons un nouveau rôle pour HRI dans la résistance à l’apoptose, en partie par l’induction des granules de stress.

Figure 1. Formation du complexe ternaire incluant eIF2 lié au GTP. Le complexe ternaire est constitué du facteur eIF2 lié au GTP ainsi que de l’ARN de transfert (ARNt) initiateur (iARNt). Ce complexe permet l’association de la petite sous-unité ribosomale avec l’ARNt initiateur, les facteurs d’initiation de la traduction et l’ARNm pour former le complexe de pré-initiation 43S (figure adaptée de [ 50]).

Figure 1. Formation du complexe ternaire incluant eIF2 lié au GTP. Le complexe ternaire est constitué du facteur eIF2 lié au GTP ainsi que de l’ARN de transfert (ARNt) initiateur (iARNt). Ce complexe permet l’association de la petite sous-unité ribosomale avec l’ARNt initiateur, les facteurs d’initiation de la traduction et l’ARNm pour former le complexe de pré-initiation 43S (figure adaptée de [ 50]).

HRI fut identifiée comme une kinase régulée par le niveau de l’hème dans les précurseurs des globules rouges. Elle comporte deux domaines de liaison à l’hème, dont l’un est inclus dans son domaine kinase (Figure 2) [ 19– 21]. Bien que le domaine kinase soit conservé dans les trois autres kinases mentionnées ci-dessus phosphorylant eIF2α, seule l’activité de HRI est affectée par le niveau de l’hème (Figure 3). En effet, la fixation de l’hème en position amino-terminale, dès la synthèse de HRI, entraîne la formation d’un homodimère de HRI pouvant s’autophosphoryler. Cette forme dimérique ne peut cependant pas fixer les molécules d’hème additionnelles qui sont nécessaires à la régulation de son activité kinase, sans l’intervention d’étapes d’autophosphorylation supplémentaires ; cette fixation d’hème au domaine catalytique inactive la kinase, qui ne peut plus phosphoryler eIF2α. En cas de déficit en hème, HRI s’active par autophosphorylation, particulièrement au niveau de la Thr485, grâce à la libération du site kinase auparavant occupé par l’hème. Ceci permet au dimère HRI de phosphoryler eIF2α [ 22]. Ce processus provoque l’inhibition de la traduction des α- et β-globines, qui constituent les protéines majeures des globules rouges. L’équilibre entre les taux de globines et d’hème, important pour la formation d’hémoglobine, est ainsi assuré [ 20]. En l’absence de HRI, et si le taux d’hème est insuffisant, la traduction des α- et β-globines se poursuit aboutissant à l’accumulation de ces molécules. Les globines en excès ont tendance à précipiter et à former des inclusions toxiques [20, 23], provoquant la lyse des globules rouges et donc une anémie [22].

Figure 2. Structure de la protéine kinase HRI. HRI possède deux sites de liaison de l’hème. Un site de liaison permanente de l’hème en position amino-terminale ; un site de liaison de l’hème dans son domaine kinase. La liaison de l’hème à ce dernier est contrôlée par le taux sanguin de l’hème (figure adaptée de [ 51]).

Figure 2. Structure de la protéine kinase HRI. HRI possède deux sites de liaison de l’hème. Un site de liaison permanente de l’hème en position amino-terminale ; un site de liaison de l’hème dans son domaine kinase. La liaison de l’hème à ce dernier est contrôlée par le taux sanguin de l’hème (figure adaptée de [ 51]).

Figure 3. Mode d’activation de HRI. HRI s’autophosphoryle en trois étapes. La liaison de l’hème à HRI entraîne sa dimérisation et une première phosphorylation (P). Une deuxième phosphorylation est nécessaire pour la liaison de l’hème au site kinase, qui régule négativement HRI (P). Un déficit en hème permet la troisième phosphorylation de HRI, qui l’active et permet de phosphoryler le facteur eIF2α (T485P). La phosphorylation d’eIF2α aura pour effet d’inhiber la traduction des chaînes α- et β-globines, ce qui rétablit l’équilibre hème-globine dans les précurseurs de globules rouges (figure adaptée de [20]).

Figure 3. Mode d’activation de HRI. HRI s’autophosphoryle en trois étapes. La liaison de l’hème à HRI entraîne sa dimérisation et une première phosphorylation (P). Une deuxième phosphorylation est nécessaire pour la liaison de l’hème au site kinase, qui régule négativement HRI (P). Un déficit en hème permet la troisième phosphorylation de HRI, qui l’active et permet de phosphoryler le facteur eIF2α (T485P). La phosphorylation d’eIF2α aura pour effet d’inhiber la traduction des chaînes α- et β-globines, ce qui rétablit l’équilibre hème-globine dans les précurseurs de globules rouges (figure adaptée de [20]).

De plus, l’anémie causée par une déficience en fer pourrait être aggravée par la déplétion en HRI via une apoptose accrue des précurseurs érythrocytaires [20, 22]. La perte de HRI a également des conséquences délétères dans d’autres modèles murins d’anémie, comme dans la protoporphyrie érythropoïétique, causée par une mutation d’une enzyme de la synthèse de l’hème. Une perte d’expression de HRI accentue les symptômes, baisse de l’hématocrite, toxicité hépatique des dépôts protéiques et photosensibilité [20, 22]. Dans la β-thalassémie – due à une mutation qui bloque l’expression du gène codant la β-globine – l’anémie est causée par une accumulation anormale d’α-globine. Puisque HRI sous sa forme active inhibe la traduction protéique, sa déplétion ne fait qu’aggraver l’accumulation toxique d’α-globine dans les précurseurs érythrocytaires [23, 24]. L’anémie sévère qui en résulte explique la létalité des embryons homozygotes pour la mutation de la β-globine. La perte d’un seul allèle du gène codant HRI aggrave significativement le phénotype des animaux modèles de β-thalassémie [23]. HRI est donc essentielle pour l’adaptation des précurseurs érythroblastiques à ces trois causes d’anémie [22]. L’ensemble de ces données démontrent que HRI s’oppose à la cytotoxicité érythroblastique dans des conditions de déficience en hème.

Le rôle de HRI n’est pas limité au contrôle de la synthèse des globines. D’autres études ont montré que cette kinase réduirait l’érythropoïèse inefficace causée par le stress oxydant induit par l’arsénite [24]. Dans les conditions de stress oxydant, la production de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS, reactive oxygen species) est augmentée [ 25]. Or, ce taux élevé de ROS entraîne l’activation de HRI en induisant son autophosphorylation [24]. La kinase activée phosphoryle eIF2α, ce qui provoque une inhibition générale de l’initiation de la traduction, à l’exception toutefois de la traduction d’ARNm spécifiques ayant des petits cadres de lecture dans leur région 5’UTR (5’ untranslated region) [ 26].

Un de ces ARNm, dont la traduction est sélectivement activée par la phosphorylation d’eIF2α, code pour ATF4 (activating transcription factor 4), un facteur de transcription de la famille des protéines bZIP (basic leucine zipper protein) [26, 27]. La traduction sélective d’ATF4 se produit quelle que soit la kinase phosphorylant eIF2α. Un des rôles majeurs d’ATF4 est de faciliter l’induction d’un programme d’expression des gènes en réponse à l’activation des kinases de stress, une réponse connue sous le nom de réponse intégrée au stress [26, 28– 30]. Dans les précurseurs érythroïdes soumis à un stress oxydant, l’activation de la voie de signalisation ATF4, via la phosphorylation d’eIF2α par HRI, est nécessaire à l’expression d’anti-oxydants, dont l’hème oxygénase 1 (HO-1), qui réduisent le stress (Figure 4) [ 31, 32] et promeuvent la différenciation érythroïde [32]. Un autre gène cible d’ATF4 code pour le facteur de transcription CHOP (C/EBP homologous protein-10), dont l’induction entraîne celle de GADD34 (growth arrest and DNA damage-inducible protein 34) ; ce dernier recrute la forme phosphorylée d’eIF2α qui subira une déphosphorylation par la phosphatase 1. Cette étape permet de régénérer eIF2α sous une forme non phosphorylée compétente pour la traduction, événement nécessaire au rétablissement de la synthèse protéique à la fin de la réponse au stress.

Figure 4. La phosphorylation d’eIF2α augmente la traduction d’ATF4. La phosphorylation d’eIF2α induit la traduction de l’ARNm codant pour le facteur de transcription ATF4 qui, lui-même, va induire la transcription de gènes cibles en réponse à différents stress.

Figure 4. La phosphorylation d’eIF2α augmente la traduction d’ATF4. La phosphorylation d’eIF2α induit la traduction de l’ARNm codant pour le facteur de transcription ATF4 qui, lui-même, va induire la transcription de gènes cibles en réponse à différents stress.

Ainsi, l’inactivation de HRI prévient l’activation d’ATF4, empêchant ainsi l’expression des gènes codant pour les anti-oxydants. Ce phénomène rend les cellules érythroïdes très sensibles au stress oxydant qui induit leur apoptose. Cependant, il faut noter que l’hème régule également la transcription de gènes codant pour des protéines telles que HO-1 via sa liaison avec le facteur de transcription BACH1 (BTB and CNC homology 1 factor) [ 33]. Ce facteur forme des complexes protéiques avec ses partenaires MAF (musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog) qui, en se liant sur des séquences de reconnaissance de MAF présentes au niveau des gènes cibles tel HO-1, répriment la transcription de ces derniers. Dans les conditions d’excès en hème, la fixation de l’hème sur BACH1 déstabilise la liaison des complexes BACH1 sur les séquences MAF, ce qui permet l’activation des gènes hébergeant ces séquences, comme le gène HO-1. Cette voie contrebalance ainsi la perte de l’expression de HO-1 qui résulte de l’inactivation de la voie HRI-ATF4 par l’hème.

Récemment, l’équipe du Dr Anderson a décrit la formation des granules de stress via HRI dans les précurseurs érythroïdes lors d’un traitement par l’arsénite [ 34]. L’inhibition de HRI réduit la formation des granules de stress en présence d’arsénite, induisant ainsi l’apoptose de ces cellules. Les mécanismes par lesquels les granules de stress induits par HRI inhibent la mort des cellules sanguines en conditions de stress oxydant restent cependant inconnus. De même, on ignore encore si la formation des granules de stress en réponse à l’activation physiologique de HRI dans les cellules hématopoïétiques lors d’une déficience en hème pourrait ainsi contribuer à leur survie. Néanmoins, ces études suggèrent un rôle critique de HRI dans la résistance des cellules hématopoïétiques au stress, en partie en induisant la formation des granules de stress via la phosphorylation d’eIF2α.

Le rôle de HRI dans la résistance à l’apoptose induite par le stress fut aussi décrit dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Le laboratoire du Dr. Kaufman a montré que, contrairement aux MEF de type sauvage, les MEF n’exprimant pas HRI ne forment pas de granules de stress en présence d’arsénite et meurent par apoptose [18]. Dans une étude pionnière [7], nous avons établi que l’activation de HRI est critique pour la formation des granules de stress dans des cellules cancéreuses exposées au bortézomib, un inhibiteur du protéasome approuvé pour le traitement des myélomes. L’inactivation de HRI par interférence à ARN inhibe la phosphorylation d’eIF2α, donc aussi la formation des granules de stress. Les mécanismes d’activation de HRI par le bortézomib sont encore inconnus, mais ils pourraient faire intervenir la production de ROS ou l’accumulation de protéines ubiquitinées.

Les protéines de choc thermique HSP90 et HSC70 ont aussi été décrites comme régulatrices de HRI dans les cellules sanguines soumises à différents types de stress [24]. L’activation de HRI par HSP90 fut attribuée à son activité chaperonne : elle permettrait la renaturation correcte de HRI ainsi que sa maturation, comme cela fut décrit dans les lysats des réticulocytes de lapin [ 35]. HSC70 semble jouer un double rôle dans la biologie de HRI [ 36]. D’une part, elle permet la renaturation de HRI pendant sa synthèse, ainsi que sa transformation en une kinase active. D’autre part, elle semble être requise pour inhiber la suractivation de HRI pendant le stress, en inhibant son hyperphosphorylation. Des études futures sont cependant nécessaires pour valider le rôle de HSP90 et HSC70 dans la régulation de HRI in vivo en conditions de stress. Ces deux chaperonnes pourraient donc aussi contribuer à l’activation de HRI dans les cellules exposées aux inhibiteurs du protéasome. Nous proposons que l’activation de HRI observée lorsque le protéasome est inhibé puisse être due à sa stabilisation, avec comme conséquence sa surexpression. Dans ce contexte, on note que la surexpression de HRI par transfection transitoire induit la formation des granules de stress, démontrant un rôle clé de HRI dans la formation de ces granules (Figure 5). Notre résultat suggère que l’activation de HRI menant à la formation des granules de stress peut être régulée par son niveau d’expression. Il serait ainsi intéressant de rechercher si le niveau d’expression de HRI dans des lignées cellulaires cancéreuses est corrélé avec la formation des granules de stress et la résistance des cellules à l’apoptose qui leur est associée. Comme prémisse, nous avons montré que l’inhibition de l’expression de HRI dans les cellules cancéreuses HeLa traitées par le bortézomib supprime la formation des granules de stress, sensibilisant ainsi les cellules à la drogue [7]. Ces travaux suggèrent donc un nouveau rôle de HRI dans la résistance à l’apoptose des cellules cancéreuses traitées par le bortézomib. Ces résultats doivent cependant être vérifiés in vivo par l’inactivation – génétique ou pharmacologique – de HRI, ce qui sensibiliserait les tumeurs humaines transplantées chez la souris au bortézomib, postulant ainsi un rôle thérapeutique de HRI.

Figure 5. La surexpression de GFP-HRI induit la formation des granules de stress. La protéine GFP-HRI a été exprimée de manière transitoire dans la lignée cellulaire HeLa. En absence de traitement, la formation de granules de stress a été observée par immunofluorescence en utilisant le marqueur G3BP dans les cellules HeLa exprimant GFP-HRI. GFP : green fluorescent protein.

Figure 5. La surexpression de GFP-HRI induit la formation des granules de stress. La protéine GFP-HRI a été exprimée de manière transitoire dans la lignée cellulaire HeLa. En absence de traitement, la formation de granules de stress a été observée par immunofluorescence en utilisant le marqueur G3BP dans les cellules HeLa exprimant GFP-HRI. GFP : green fluorescent protein.

Si l’on envisage d’utiliser HRI comme cible thérapeutique, il est nécessaire de mieux en comprendre le mode d’activation. Il serait aussi intéressant d’étudier l’implication de cette kinase dans la résistance cellulaire induite par différentes drogues chimiothérapeutiques pour déterminer si HRI joue un rôle général dans la chimiorésistance. Ces études pourraient aboutir à l’utilisation d’une combinaison d’agents chimiothérapeutiques existants et de modulateurs de HRI pour contourner les processus de chimiorésistance. En conclusion, l’étude de la kinase HRI permettra peut-être de proposer de nouveaux traitements aux patients atteints de cancers résistants aux drogues actuelles.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

F.H. Joncas est étudiante au baccalauréat sciences biomédicales (faculté de médecine de l’Université Laval). P. Adjibade, étudiante au doctorat, est titulaire de la bourse d’étude Pierre Durand offerte par la faculté de médecine de l’Université Laval. Ce travail est supporté par la subvention de la Société canadienne de recherche sur le cancer (volet innovation ; numéro 702406) octroyée à R. Mazroui. R. Mazroui est titulaire de la bourse salariale nouveau chercheur des Instituts de recherche en santé du Canada.