Nous avons relaté il y a quelques mois dans une Nouvelle les résultats de la complémentation de blastocystes de souris pdx1^-/- (un gène clé de la spécification du pancréas) par des iPS (induced pluripotent stem cells) de rat. Après leur transfert dans un utérus de souris, certains de ces embryons chimères interespèces ont abouti à la naissance de souris dont le pancréas, tout à fait fonctionnel, était entièrement dérivé des iPS de rat [ 1]. Il y avait donc deux résultats : la création d’une chimère interespèce (souris/rat), et la restauration d’un organe complet, le pancréas, chez l’espèce qui en était dépourvue. Il était clair que l’équipe de H. Nakauchi ne s’arrêterait pas là. La seconde étape, l’application de cette démarche à un gros animal, le porc, vient d’être publiée dans Proceedings of the National Academy of Sciences of USA [ 2].

Le développement du pancréas a été bloqué in vivo chez les porcs par la surexpression d’un transgène, Hes1 (hairy enhancer of split), un gène cible de la voie Notch dont on connaît le rôle inhibiteur sur la différenciation du pancréas endocrine. Ces porcs transgéniques ont été obtenus par l’injection, dans le cytoplasme d’ovocytes (par ICSI, intracytoplasmic sperm injection), de spermatozoïdes ayant incorporé la construction Pdx1-Hes1, dans laquelle l’expression du gène Hes1 est sous le contrôle du promoteur du gène Pdx1, indispensable à l’acquisition de l’identité du pancréas (Figure 1A). Onze fœtus furent obtenus sur 1 282 embryons obtenus par ICSI et transférés, dont deux n’avaient qu’une minuscule ébauche de pancréas (5 % du volume de l’organe normal). Des fibroblastes ont été prélevés sur le fœtus mâle sans pancréas, et amplifiés in vitro. Les noyaux de ces fibroblastes, transférés dans des ovocytes énucléés, ont permis de « cloner » des embryons qui, une fois transférés dans l’utérus, se développent en fœtus également dépourvus de pancréas (9 fœtus sur 229 embryons clonés).

Figure 1. Démarche expérimentale. A. Dérivation de porcs dépourvus de pancréas par insertion du transgène Pdx1-hes1 surexprimant Hes1 dans le pancréas (sous contrôle du promoteur Pdx1), et obtention d’embyrons Pdx1-hes1 par transfert nucléaire. B. Obtention d’embryons exprimant le transgène codant pour l’étiquette fluorescente orange (Kusabira-Orange). C. Complémentation des blastocystes Pdx-Hes1 par des blastomères provenant d’embryons transgéniques pour l’étiquette Kusabira-Orange, et transfert des embryons chimères dans un utérus de truie. Des porcs chimériques normaux, porteurs d’un pancréas provenant exclusivement des blastomères « orange » ont été obtenus. Ils ont été croisés avec des femelles normales ; les gamètes mâles étant exclusivement d’origine hôte, non chimériques, la descendance était dépourvue de pancréas.

Figure 1. Démarche expérimentale. A. Dérivation de porcs dépourvus de pancréas par insertion du transgène Pdx1-hes1 surexprimant Hes1 dans le pancréas (sous contrôle du promoteur Pdx1), et obtention d’embyrons Pdx1-hes1 par transfert nucléaire. B. Obtention d’embryons exprimant le transgène codant pour l’étiquette fluorescente orange (Kusabira-Orange). C. Complémentation des blastocystes Pdx-Hes1 par des blastomères provenant d’embryons transgéniques pour l’étiquette Kusabira-Orange, et transfert des embryons chimères dans un utérus de truie. Des porcs chimériques normaux, porteurs d’un pancréas provenant exclusivement des blastomères « orange » ont été obtenus. Ils ont été croisés avec des femelles normales ; les gamètes mâles étant exclusivement d’origine hôte, non chimériques, la descendance était dépourvue de pancréas.

Une fois cette étape d’obtention de porcs a-pancréatiques validée, des blastocystes Pdx1-Hes1 mâles « clonés » par transfert nucléaire ont été « complémentés » par l’injection d’une dizaine de blastomères issus d’embryons (morula) porteurs d’un gène Pdx1 normal et transgéniques pour un ADNc codant pour une étiquette fluorescente orange (Figure 1C). Ces embryons ont été dérivés également par transfert de noyaux de fibroblastes de femelles transgéniques dans des ovocytes (Figure 1B). Parmi les 96 embryons chimériques « complémentés » transférés dans l’utérus de truies, 14 se développèrent jusqu’au terme (110 jours). Cinq de ces fœtus étaient mâles et chimériques (les 9 autres n’étaient pas chimériques, ils étaient soit mâles et dépourvus de pancréas, soit femelles, issus des blastomères normaux). Dans les cinq chimères analysées, le pancréas était normal, anatomiquement et histologiquement, et toutes les cellules émettaient une fluorescence orange, indiquant qu’il s’était développé à partir des blastomères femelles. Les autres tissus étaient composites, avec 40 à 60 % de cellules fluorescentes orange XX, indiquant un chimérisme homogène. La procédure de complémentation fut répétée avec d’autres cellules « complémentantes » normales, facilement reconnaissables, et cinq porcelets vivants obtenus sur 19 embryons transférés. Tous les cinq étaient des mâles ; au cours des 12 mois de suivi, tous se développèrent normalement sans qu’aucune anomalie du métabolisme du glucose ne soit constatée. Un d’entre eux fut sacrifié à un an pour analyser le pancréas, qui s’avéra tout à fait normal et composé presqu’exclusivement de cellules issues des cellules « complémentantes » normales. Les quatre porcelets restants étaient fertiles, mais leur descendance (après croisement avec des femelles normales) était dépourvue de pancréas : ceci indique que les gamètes mâles des porcelets étaient exclusivement d’origine hôte (et porteurs du transgène Pdx1-Hes1). Ce n’était pas une surprise, car cette incapacité de cellules femelles XX à participer à la production de gamètes mâles dans les chimères a déjà été décrite chez le porc comme chez la souris.

Les auteurs confirment donc que la « fabrication » d’un organe entier fonctionnel est possible chez un gros animal via une procédure de complémentation de blastocystes dont ils avaient fait la preuve de concept chez le rongeur précédemment [1, 2]. Les auteurs ont évidemment en tête un autre « gros animal », l’homme, et la complémentation des embryons Pdx-Hes1 porcins par des cellules souches pluripotentes humaines, iPS en priorité. Mais ils ne sous-estiment pas les obstacles qu’ils devront franchir : la première est inhérente aux cellules pluripotentes : celles des primates ou de l’homme sont plus matures que celles des rongeurs, et, si l’on se réfère aux essais de création de chimères récemment publiés chez le singe [ 4] et rapportés dans médecine/sciences [ 5], sont spontanément probablement limitées dans ce potentiel de contribuer à des chimères post-natales. La seconde difficulté est la barrière d’espèce, et l’efficacité de la complémentation de blastocystes de porcs par des iPS de singe, de vache (nul doute que ces essais soient en cours) ou humaines est loin d’être acquise. Au-delà, et si ces difficultés trouvent des solutions, on se heurtera à plusieurs problèmes éthiques, dont celui d’un éventuel développement de gamètes humains dans de telles chimères. Il est vrai que la configuration utilisée ici ne le permet probablement pas, puisque plusieurs études ont démontré que des cellules XX « complémentantes » ne se développent pas en gamètes mâles dans des blastocystes mâles. On peut aussi imaginer bloquer le développement de ces gamètes, soit selon une stratégie proche de celle utilisée ici pour bloquer le développement du pancréas, ou via une stratégie de gène suicide, déjà envisagée pour éliminer des dérivés tissulaires d’iPS qui se comporteraient de façon aberrante après leur transplantation.

En ces temps de crise, les Japonais prédisent même que cette approche de création d’organes pourrait être moins coûteuse que certaines approches médicales actuelles : l’obtention de sperme de porcs Pdx-Hes1 est possible en grande quantité et le clonage d’embryons transgéniques semble presque routinier. Quant à la greffe d’îlots pancréatiques, elle sera faite en conditions « autologues », donc sans immunosuppression, geste bien codifié et sans danger. En somme il n’y a plus qu’à… Optimisme exagéré ou réalisme, toujours est-il qu’on peut s’étonner, et peut-être s’inquiéter, de l’absence de débat en France sur les questions que soulèvent ces stratégies…

L’auteur déclare n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.