La bactérie Escherichia coli est le système de production de protéines membranaires le plus commun. Il est simple, peu coûteux, le temps de génération du bacille est court, il peut être manipulé sans danger, et les volumes de culture peuvent être aisément augmentés. De plus, les rendements d’expression sont élevés et la protéine recombinante est structuralement homogène (pas de modifications post-traductionnelles chez E. coli). Les RCPG sont ciblés soit à la membrane interne, soit en corps d’inclusion cytoplasmiques, dans les deux cas sous forme de protéines de fusion par un couplage à un partenaire ou un épitope court. Les corps d’inclusion représentent une alternative intéressante, mais la protéine recombinante doit être manipulée en conditions dénaturantes, puis être ensuite repliée sous forme native et fonctionnelle. La production du récepteur NTS1 de la neurotensine est sans conteste le plus bel exemple de succès d’expression et de purification d’un RCPG à grande échelle par l’approche d’insertion membranaire [1]. Les données accumulées pour les récepteurs BLT1 et BLT2 du leucotriène LTB₄ sont nombreuses et montrent que l’accumulation en corps d’inclusion bactériens est également particulièrement prometteuse [2]. Aujourd’hui, l’approche « bactérie » a conduit à la détermination par résonance magnétique nucléaire (RMN) de la structure tridimensionnelle (3D) de ligands liés à deux récepteurs purifiés, celle de la neurotensine et celle du leucotriène LTB₄ [ 3, 4].

La levure, eucaryote unicellulaire, combine plusieurs avantages. Elle réalise la plupart des modifications post-traductionnelles effectuées chez les eucaryotes supérieurs, ses conditions de culture en suspension sont équivalentes à celles des bactéries et elle peut, comme E. coli, être manipulée aisément d’un point de vue génétique. La glycosylation des protéines chez les levures (plutôt hyperglycosylation), ainsi que la composition de la membrane plasmique (pas de cholestérol) de cet organisme, diffèrent de celles des cellules de mammifères. Cela peut avoir des conséquences cruciales sur le repliement, la stabilité ou l’activité des RCPG recombinants. Deux souches sont généralement utilisées, Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris, la deuxième présentant l’avantage de pouvoir être cultivée à très haute densité. L’expression et la purification du RCPG µ-opioïde ont été particulièrement optimisées chez P. pastoris [5]. La structure 3D du complexe récepteur H1 de l’histamine avec la doxepine (antagoniste) vient d’être publiée, suite à l’expression de ce RCPG chez P. pastoris [6].

L’infection de cellules d’insecte par un baculovirus recombinant constitue aujourd’hui une des méthodes de surexpression des RCPG les plus valorisées. Même si les milieux de culture sont beaucoup plus coûteux que ceux utilisés pour les bactéries ou les levures, ce système reste mieux adapté à une culture à grande échelle que les cellules de mammifère. La glycosylation des protéines recombinantes y reste limitée à l’addition de mannose, et la membrane plasmique des cellules présente un taux de cholestérol faible. Cependant, les rendements de production des RCPG sont élevés. La fonctionnalité des RCPG, mesurée par des tests de liaison de radioligands ou par le couplage à des protéines G purifiées, est identique à celle des récepteurs exprimés dans leur environnement cellulaire original. Le système Bac to Bac^TM, fondé sur l’utilisation d’un plasmide bactérien recombinant dans lequel le gène codant pour le RCPG est inséré au sein de séquences de recombinaison avec le génome du virus, est actuellement le plus populaire. Les cellules les plus utilisées sont celles de lépidoptères, comme les Sf9 (Spodoptera frugiperda). La grande majorité des structures 3D des RCPG complexés à des antagonistes ou à des agonistes publiées récemment, par exemple celles des récepteurs β1 et β2 adrénergiques (β1AR et β2AR), D3 de la dopamine, CXCR4 des chimiokines, et A_2A de l’adénosine, ont été déterminées après production des récepteurs en cellules Sf9 [7– 11].

Les cellules de mammifère représentent théoriquement le système idéal de surexpression des RCPG puisqu’elles constituent l’environnement naturel des récepteurs (même si les RCPG sont aussi des protéines endogènes chez d’autres organismes non-mammifères). Cependant, l’obtention de récepteurs purs en quantités compatibles avec les approches de biologie structurale s’avère très onéreuse (milieux de culture coûteux, mise en place d’incubateurs à atmosphère contrôlée, difficulté d’optimiser les cultures à grande échelle). De plus, les modifications post-traductionnelles, telles que la glycosylation, peuvent mener à l’obtention de préparations protéiques très hétérogènes, ce qui est un désavantage pour des perspectives de cristallogenèse. L’expression des RCPG en cellules mammifères est réalisée par transfection transitoire, par sélection de clones recombinants stables ou par infection à l’aide de vecteurs viraux. La première structure atomique d’un RCPG recombinant est celle d’un mutant thermostable de la rhodopsine surexprimé de façon transitoire dans les cellules COS-1 [12]. Plus d’une centaine de RCPG recombinants ont été surexprimés dans des cellules BHK-21 (baby hamster kidney cell-21) infectées par le virus SVF (Semliki Forest virus) [13]. Cette méthode est attractive, car le virus peut infecter un grand nombre de lignées cellulaires et de cultures primaires, et il s’adapte aux cultures adhérentes ou en suspension (bioréacteurs).

La rétine des yeux de souris transgéniques (ou même de drosophile et de xénope) constitue une nouvelle alternative à la surexpression des RCPG. Cette stratégie est basée sur l’observation que la rhodopsine, seul RCPG dont la structure 3D a été déterminée grâce à sa purification à partir de membranes natives, est compactée naturellement à très haute densité dans les membranes spécialisées des cellules photoréceptrices. L’idée de remplacer dans ces membranes la rhodopsine par d’autres RCPG sous le contrôle de promoteurs spécifiques est donc très attractive. Elle a porté ses fruits vis-à-vis de plusieurs récepteurs cibles, comme le récepteur métabotropique du glutamate de drosophile [ 14], le récepteur 5HT_1A humain de la sérotonine [ 15] et le récepteur A₁ murin de l’adénosine [16].

Enfin, les RCPG peuvent être produits in vitro dans des systèmes acellulaires qui miment l’environnement naturel du cytoplasme des cellules. Ces systèmes acellulaires contiennent en général des extraits de bactéries, de germe de blé ou de réticulocytes de lapin pour assurer une synthèse protéique continue. On peut directement y manipuler les composants bénéfiques au repliement et à la stabilité des récepteurs recombinants, en particulier des détergents, des liposomes, des amphipols^1, et même des ligands spécifiques. L’efficacité de cette approche, indépendante des contraintes du maintien en culture des cellules vivantes ou de la génération d’animaux transgéniques, a été prouvée pour plusieurs RCPG. On peut citer le récepteur ET_A de l’endothéline [17].

La purification d’une protéine membranaire, telle qu’un RCPG, nécessite au préa-lable une solubilisation des membranes plasmiques [ 18]. Cette étape est généralement accomplie à l’aide de détergents, surfactants qui solubilisent les lipides et autres molécules hydrophobes et qui sont des petites molécules amphipathiques (Figure 1). Ces détergents désorganisent les membranes tout en mimant un environnement lipidique naturel ce qui permet de maintenir les protéines membranaires en solution. Le succès de la purification d’un RCPG et de sa stabilisation sous forme fonctionnelle dépend directement du (des) détergent(s) utilisé(s) au cours des étapes initiales de solubilisation et des étapes successives de purification [18]. Les détergents utilisés pour solubiliser les membranes ne sont pas forcément les plus appropriés pour stabiliser et cristalliser les RCPG, ce qui peut donc amener à changer de détergent au cours des différentes étapes biochimiques. Pour maintenir un RCPG sous une forme fonctionnelle, il est préférable d’utiliser des détergents non dénaturants (doux) tels que le CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)-diméthylammonio]-1-propane sulfonate), le DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyrannoside) et le sodium cholate. Par son effet stabilisant vis-à-vis des RCPG, le cholestérol, qui est un constituant naturel de la membrane plasmique chez les mammifères, peut être ajouté lors de l’étape de solubilisation [ 19].

Les récepteurs solubilisés ne sont pas des protéines isolées mais plutôt des complexes associant détergents et lipides membranaires [ 20]. Ces complexes RCPG/détergents/lipides ont des propriétés physicochimiques particulières (diamètre, volume, masse) et ne sont pas nécessairement des particules homogènes. La concentration du (des) détergent(s) détermine la quantité de lipides associée au RCPG solubilisé. En général, un rapport de poids détergent/protéine de 1/2 est suffisant pour solubiliser les membranes et générer les complexes RCPG. Un rapport plus élevé entraîne la délipidation des RCPG.

Les RCPG enchâssés dans les micelles de détergent peuvent être purifiés jusqu’à homogénéité sous forme fonctionnelle. On peut mesurer leurs propriétés de liaison par des tests de liaison de radioligands pour calculer un Bmax expérimental (nombre de sites-récepteurs actifs exprimé en nmoles de récepteur/mg de protéine), ainsi que leurs propriétés d’activation des protéines G par une mesure d’incorporation de nucléotides [ 21]. Cependant, les RCPG peuvent être solubilisés tout en étant incorrectement repliés, et donc rester non fonctionnels (incapables de lier des ligands et/ou des protéines G). Pour isoler les récepteurs fonctionnels, plusieurs approches sont nécessaires et souvent combinées (Tableau I).

Depuis la caractérisation des premiers gènes codant pour les RCPG à la fin des années 1980, les techniques de clonage recombinant permettent d’introduire facilement des séquences épitopes à l’extrémité amino- ou carboxy-terminale de chaque récepteur, contre lesquelles des anticorps spécifiques sont développés. L’épitope Flag, reconnu par les anticorps M1 et M2, a été positionné par exemple à l’extrémité amino-terminale du β2AR et permet une purification efficace du récepteur [7]. L’épitope 6×His (constitué de 6 histidines successives) est souvent introduit à l’extrémité carboxy-terminale des RCPG [ 22]. Le tag 6×His peut être reconnu par un anticorps spécifique, mais plus généralement par les ions nickel. Les ions nickel existent généralement sous forme de complexes Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid) ou Ni-IDA (nickel-iminodiacetate). Les anticorps ou les ions nickel sont la plupart du temps greffés sur des résines rendant les approches de purification par chromatographie d’affinité systématiques et quelquefois automatisées. Pour les ions nickel, on parle de chromatographie IMAC (immobilized metal affinity chromatography) et c’est aujourd’hui la méthode la plus utilisée par les laboratoires pour purifier un RCPG.

L’accessibilité des épitopes est un critère majeur de réussite dans la purification des RCPG. Si l’épitope est trop proche du cœur transmembranaire du RCPG, il peut être partiellement masqué par la « ceinture » de détergents, et donc être peu accessible à un anticorps ou à une résine d’affinité. Les RCPG dont l’épitope est bien exposé peuvent être purifiés rapidement à l’aide de résines commercialisées sous forme de colonnes (le paramètre d’affinité entre l’épitope et son anticorps ou le nickel est cependant crucial), condition sine qua non pour automatiser la procédure de chromatographie. En règle générale, l’accessibilité d’un épitope sera plus difficile si le récepteur est enchâssé dans une « ceinture » de détergents à concentration micellaire critique² (cmc) basse. Cela s’explique directement par la longueur des molécules de détergent et, en conséquence, par le volume de la « ceinture » qu’ils composent : plus la cmc est basse, plus la « ceinture » est large. Il faut donc privilégier des détergents à cmc élevée. De ce point de vue, les amphipols peuvent représenter une alternative intéressante aux détergents [ 23]. L’échange d’une micelle de détergents par un amphipol s’applique facilement aux RCPG.

La purification IMAC ne discrimine pas les récepteurs fonctionnels des récepteurs inactifs. Une deuxième étape s’avère donc indispensable, quoique certains récepteurs aient été purifiés quasiment à homogénéité en une étape IMAC unique. Celle-ci est en général une chromatographie d’affinité mettant en jeu une résine sur laquelle a été greffé un ligand spécifique du récepteur cible (étape de purification fonctionnelle). Par exemple, une résine alprénolol (antagoniste β-adrénergique), une résine neurotensine (agoniste) ou une résine XAC (xanthine amine congener, antagoniste) ont été développées pour purifier à homogénéité les récepteurs β2AR, NTS1 et A_2A respectivement [19, 24, 25]. À noter que certains ligands peuvent être couplés à une biotine sans entraîner une perte d’affinité, et donc permettre la purification de leurs récepteurs spécifiques par l’utilisation d’une résine avidine. C’est le cas par exemple du récepteur PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide) purifié à l’aide d’un ligand PACAP38 biotinylé [ 26].

Une purification de type chromatographie d’exclusion (filtration sur gel) peut s’avérer tout à fait complémentaire aux approches de chromatographie d’affinité. En effet, le passage d’une préparation de RCPG à travers une colonne de filtration sur gel très résolutif peut séparer les constituants de l’échantillon selon leurs propriétés physicochimiques (diamètre, volume, masse). Ce type d’approche permet d’isoler, par exemple, un récepteur monomérique de ses dimères, mais aussi d’éliminer des agrégats non fonctionnels.

L’accumulation d’un RCPG en corps d’inclusion chez la bactérie constitue un cas particulier [ 27]. Les corps d’inclusion n’ont rien à voir avec une membrane biologique et ne peuvent pas être dissociés à l’aide de détergents doux. Seuls des détergents ioniques « décapants » tels que le sodium dodécyl sulfate (SDS), le n-lauroyl sarcosine, ou des agents chaotropes comme l’urée et le guanidinium hydrochloride, solubilisent les corps d’inclusion. Mais ils entraînent systématiquement la dénaturation de la protéine recombinante. Une étape de renaturation au cours de laquelle l’agent dénaturant est remplacé par un détergent doux ou un amphipol doit donc être mise au point [ 28], et la fonctionnalité du RCPG vérifiée.

Dans la première catégorie de molécules se trouvent notamment les MNG (maltose-néopentylglycol) [ 33]. Ces composés sont des détergents originaux qui ont pour principale caractéristique la présence d’un carbone quaternaire central qui restreint la flexibilité conformationnelle de la molécule. Ils permettent, d’une part, d’extraire la protéine d’intérêt de la membrane mais, qui plus est, de la stabiliser en solution bien mieux que ne le font les détergents classiques (Figure 1). Les MNG ont ainsi été utilisés pour purifier et cristalliser le complexe entre le β2AR et la protéine Gs [ 34]. Parmi les autres surfactants originaux se trouvent les composés fluorés et hémifluorés [ 35]. Ces composés présentent une structure chimique proche de celle des détergents classiques, à l’exception du fait que leur chaîne hydrocarbonée contient des atomes de fluor. La faible miscibilité des alcanes et des alcanes perfluorés empêche la partition des lipides et des cofacteurs lipidiques dans ces surfactants, réduisant ainsi la dénaturation de la protéine d’intérêt. Si l’effet stabilisant de ces molécules a été démontré pour de nombreuses protéines membranaires intégrales, leur application aux RCPG reste à ce jour limitée. D’autres surfactants originaux ont été décrits, tels que des composés bicaténaires mimant la structure des phospholipides membranaires ou encore des composés de type lipopeptide. Ces molécules ont permis de maintenir certaines protéines membranaires en solution, mais l’extension aux RCPG reste encore anecdotique [ 36].

Une autre possibilité pour stabiliser le repliement natif des récepteurs en solution consiste à employer des systèmes qui miment au plus près la membrane. Les plus répandus sont les bicelles et les nanodisques. Les bicelles sont des structures discoïdales composées d’une bicouche lipidique stabilisée par des lipides à chaîne courte ou par des détergents particuliers. Elles ont été employées pour maintenir en solution de multiples protéines membranaires et quelques RCPG tels que le récepteur 5-HT_4A de la sérotonine ou la rhodopsine [ 37]. Les nanodisques sont également des disques lipidiques, de taille parfaitement contrôlée (Figure 1), dont la structure en bicouche est stabilisée non pas par des détergents, mais par des lipoprotéines hélicoïdales appelées MSP (membrane scaffolding protein) [ 38]. Si, dans le cas des bicelles, la taille du disque peut être modulée en faisant varier les rapports entre ses différentes composantes, il existe également des MSP de tailles différentes qui génèrent des disques de diamètre variable mais parfaitement bien défini. Un nanodisque constitue donc un environnement phospholipidique proche de l’environnement natif qui permet, de plus, un contrôle strict de l’état oligomérique de la protéine. La facilité de manipulation des nanodisques, ainsi que la stabilité et le maintien de la fonction biologique de la protéine insérée dans cette structure, rendent leur utilisation extrêmement attrayante pour l’étude des mécanismes moléculaires responsables de l’activation des RCPG, comme illustré par de récents travaux avec les récepteurs β2AR, µ-opioïde, GHS-R1a de la ghréline ou la rhodopsine [ 39].

La dernière classe de surfactants que nous mentionnerons ici est celle des amphipols [23, 40]. Les amphipols sont des polymères amphiphiles, de longueur et de composition bien définies, qui forment un complexe stable avec la protéine membranaire et la maintient ainsi en solution sans la dénaturer (Figure 1). Différentes catégories de polymères ont été développées au cours des dernières années qui varient par leurs propriétés physicochimiques. Outre leur facilité d’utilisation, l’avantage de ces composés est que, contrairement aux détergents classiques, le complexe protéine/amphipol est suffisamment stable et autorise l’absence de toute molécule de polymère libre. Ainsi, la protéine stabilisée par les amphipols se comporte quasiment comme une protéine hydrosoluble classique, ce qui rend sa manipulation aisée pour des études fonctionnelles et structurales. Il faut souligner que les amphipols peuvent être utilisés non seulement pour maintenir le repliement natif de certains RCPG en solution, mais également pour les renaturer efficacement in vitro, dans le cadre de stratégies fondées sur l’expression des récepteurs dans les corps d’inclusion bactériens (voir plus haut) [ 41].