Les ARN pré-messagers transcrits dans le noyau par l’ARN polymérase II ADN-dépendante (ARN Pol II) subissent plusieurs modifications co- et post-transcriptionnelles, puis sont exportés vers le cytoplasme et traduits en protéines par les ribosomes. Parmi ces modifications, on trouve l’addition d’une structure coiffe à l’extrémité 5’ des ARNm, l’épissage des introns et la synthèse d’une queue poly A [1, 2]. La coiffe est constituée d’une guanosine méthylée en position N7 liée par une liaison 5’-5’ triphosphate au premier nucléotide transcrit de l’ARNm (^7MeGpppN) (Figure 1). Son rôle principal est de recruter le facteur eIF4E (eukaryotic translation initiation factor 4E), afin de permettre l’initiation de la traduction des ARNm en protéines [3]. La coiffe protège également les ARNm de leur dégradation par les nucléases cellulaires, facilite l’excision de séquences introniques [4] et empêche la détection des ARNm par les senseurs de l’immunité innée RIG-1 (retinoic acid inducible gene 1 protein) et MDA5 (melanoma-differentiation-associated gene 5) [2, 5, 6, 31].

Figure 1. Structure de la coiffe. La structure coiffe-0 (fond bleu) est composée d’un résidu guanosine méthylé en position N7 (cercle vert à gauche) qui est lié par une liaison 5’-5’ triphosphate (fond rose) au nucléotide en aval de la coiffe. Un groupement méthyl (cercle vert à droite) peut être ajouté à la position 2’O du ribose du premier nucléotide de l’ARNm pour former la coiffe-1.

Figure 1. Structure de la coiffe. La structure coiffe-0 (fond bleu) est composée d’un résidu guanosine méthylé en position N7 (cercle vert à gauche) qui est lié par une liaison 5’-5’ triphosphate (fond rose) au nucléotide en aval de la coiffe. Un groupement méthyl (cercle vert à droite) peut être ajouté à la position 2’O du ribose du premier nucléotide de l’ARNm pour former la coiffe-1.

La formation de la coiffe chez les eucaryotes nécessite l’action séquentielle de plusieurs activités enzymatiques (Figure 2A). La première étape consiste en l’hydrolyse du phosphate γ de l’extrémité 5’ triphosphate de l’ARNm naissant par une ARN triphosphatase (RTPase). L’ARN guanylyltransférase (GTase) recrute une molécule de GTP et forme un intermédiaire covalent via sa lysine catalytique, avant de transférer le groupement GMP sur l’extrémité 5’ de l’ARN diphosphate. Enfin, une N7-méthyltransférase (N7-MTase) méthyle la guanosine sur la position N7 en utilisant comme donneur de méthyl le S-adénosyl-L-méthionine (SAM ou AdoMet) [1, 2]. L’inactivation d’une seule des trois enzymes impliquées dans la formation de la coiffe est létale pour les cellules, ce qui démontre l’importance de la coiffe pour la survie cellulaire [1].

Figure 2. Différents mécanismes de formation de la coiffe. A. Ce panneau représente le mécanisme « conventionnel » de formation de la coiffe chez les eucaryotes. Le phosphate γ à l’extrémité 5’ de l’ARN pré-messager est hydrolysé par l’ARN triphosphatase (RTPase). L’ARN guanylyltransférase (GTase) fixe ensuite une molécule de GMP à partir du GTP (Gppp) en libérant du pyrophosphate inorganique (PPi). La GTase transfère le GMP sur l’extrémité diphosphate de l’ARN prémessager formant une liaison 5’-5’ triphosphate. La synthèse de la coiffe se termine par la méthylation du résidu guanosine en position N7 par la N7-MTase à partir du donneur de méthyl (SAM). Enfin, chez les eucaryotes supérieurs, la formation de la structure coiffe-1 fait intervenir une 2’O-MTase qui méthyle la position 2’O du ribose du premier nucléotide de l’ARN. B.Ce panneau illustre le mécanisme de formation de la coiffe chez les Vésiculovirus. La PRNTase recrute l’ARN triphosphate pour former un lien covalent avec l’ARN 5’ diphosphate et le transfère ensuite sur une molécule de GDP (Gpp). L’ordre de la séquence de méthylation est inversé par rapport au mécanisme canonique retrouvé chez les eucaryotes (A.). C. Ce panneau illustre le mécanisme de coiffe des Alphavirus où la N7-méthylation précède le transfert du GMP sur l’ARN diphosphate.

Figure 2. Différents mécanismes de formation de la coiffe. A. Ce panneau représente le mécanisme « conventionnel » de formation de la coiffe chez les eucaryotes. Le phosphate γ à l’extrémité 5’ de l’ARN pré-messager est hydrolysé par l’ARN triphosphatase (RTPase). L’ARN guanylyltransférase (GTase) fixe ensuite une molécule de GMP à partir du GTP (Gppp) en libérant du pyrophosphate inorganique (PPi). La GTase transfère le GMP sur l’extrémité diphosphate de l’ARN prémessager formant une liaison 5’-5’ triphosphate. La synthèse de la coiffe se termine par la méthylation du résidu guanosine en position N7 par la N7-MTase à partir du donneur de méthyl (SAM). Enfin, chez les eucaryotes supérieurs, la formation de la structure coiffe-1 fait intervenir une 2’O-MTase qui méthyle la position 2’O du ribose du premier nucléotide de l’ARN. B.Ce panneau illustre le mécanisme de formation de la coiffe chez les Vésiculovirus. La PRNTase recrute l’ARN triphosphate pour former un lien covalent avec l’ARN 5’ diphosphate et le transfère ensuite sur une molécule de GDP (Gpp). L’ordre de la séquence de méthylation est inversé par rapport au mécanisme canonique retrouvé chez les eucaryotes (A.). C. Ce panneau illustre le mécanisme de coiffe des Alphavirus où la N7-méthylation précède le transfert du GMP sur l’ARN diphosphate.

La synthèse nucléaire de la structure coiffe est couplée à la transcription des ARNm par l’ARN Pol II. En effet, les enzymes de formation de la coiffe sont recrutées via le domaine carboxy-terminal (CTD) de l’ARN Pol II, après phosphorylation au niveau de la sérine 5 du motif YSPTSPS [7]. Chez les eucaryotes supérieurs, les nucléotides adjacents à la coiffe peuvent également être méthylés en position 2’O de leur groupement ribose par des 2’O-méthyltransférases (2’O-MTases), hMTr1 (human methyltransferase 1) et hMTr2 chez l’humain, générant respectivement des structures coiffe-1 (^7MeGpppN_2’OMepN) ou coiffe-2 (^7MeGpppN_2’OMepN_2’OMe). Il semble que ces méthylations en position 2’O favorisent la reconnaissance des ARNm par les ribosomes dans des conditions limitantes en eIF4E [8] et empêchent la reconnaissance des ARNm par la protéine MDA5, qui induit les mécanismes de l’immunité innée [6].

Les virus utilisent la machinerie de la cellule infectée afin de traduire leur ARNm en protéines. Bien que certains virus possèdent des structures IRES (internal ribosome entry site) permettant la traduction des ARNm en absence de structure coiffe [9], la plupart des virus coiffent l’extrémité 5’ de leurs ARNm afin de permettre leur traduction par les ribosomes cellulaires. Trois procédés permettant l’acquisition d’une coiffe par les ARNm viraux ont été décrits [2]. Les virus dont les ARNm sont synthétisés par l’ARN Pol II utilisent les enzymes cellulaires pour la formation de la coiffe. C’est le cas des rétrovirus et de la plupart des virus à ADN (Hepadnaviridae et Parvoviridae) à l’exception des Poxviridae et Herpesviridae. Une stratégie alternative consiste à subtiliser la coiffe des ARNm cellulaires déjà coiffés dans un processus appelé « vol de coiffe » (cap-snatching). Cette stratégie, utilisée notamment par les Orthomyxoviridae, les Arenaviridae et les Bunyaviridae, implique une endonucléase qui clive les ARNm cellulaires à des sites situés quelques nucléotides en aval de la structure coiffe [10]. Ces petits fragments d’ARN sont ensuite utilisés comme amorces par l’ARN polymérase ARN-dépendante virale qui synthétise les ARNm viraux. Enfin, la dernière stratégie utilisée par les virus consiste à coder et synthétiser la machinerie enzymatique nécessaire à la formation de leur structure coiffe (Figure 2B et 2C). Cette stratégie est notamment utilisée par la plupart des virus à ARN dont le cycle réplicatif est cytoplasmique. Bien que les machineries enzymatiques virales impliquées dans la formation de la coiffe soient extrêmement divergentes du point de vue de l’organisation structurale, des mécanismes réactionnels et de la fonctionnalité des enzymes, les coiffes virales sont identiques aux coiffes cellulaires, et l’inhibition ou la mutation des enzymes virales a des effets délétères sur la réplication virale [2].

Les RTPases catalysent la première étape de la réaction de formation de la coiffe en hydrolysant le phosphate γ de l’ARNm. On distingue deux familles de RTPases. D’une part, les RTPases dont l’activité dépend de cations divalents (Figure 3A, 3B, 3C) et, d’autre part, les enzymes appartenant à la superfamille des cystéines phosphatases qui sont indépendantes des ions (Figure 3D).

Figure 3. Structures des quatre classes canoniques de RTPases virales. Les structures des protéines sont représentées sous forme de rubans. Le détail des sites catalytiques est présenté sous chaque structure. Les chaînes latérales des résidus du site actif sont représentées en « bâtons ». Le code couleur de la représentation des chaînes latérales est : bleu : azote ; gris : carbone ; orange : phosphate ; rouge : oxygène. A. Structure de la RTPase de Mimivirus avec une architecture TTM (PDB [protein data bank] : 2QZE), dont l’activité est dépendante de cations divalents. B. Structure quaternaire de la protéine NSP2 de Rotavirus avec un repliement de type HIT-like (PDB : 1L9V). C. Structure du domaine RTPase/ARN hélicase de la protéine NS3 du virus de la dengue (PDB : 2BHR). D. Structure de la protéine BVP de Baculovirus (PDB : 1YN9).

Figure 3. Structures des quatre classes canoniques de RTPases virales. Les structures des protéines sont représentées sous forme de rubans. Le détail des sites catalytiques est présenté sous chaque structure. Les chaînes latérales des résidus du site actif sont représentées en « bâtons ». Le code couleur de la représentation des chaînes latérales est : bleu : azote ; gris : carbone ; orange : phosphate ; rouge : oxygène. A. Structure de la RTPase de Mimivirus avec une architecture TTM (PDB [protein data bank] : 2QZE), dont l’activité est dépendante de cations divalents. B. Structure quaternaire de la protéine NSP2 de Rotavirus avec un repliement de type HIT-like (PDB : 1L9V). C. Structure du domaine RTPase/ARN hélicase de la protéine NS3 du virus de la dengue (PDB : 2BHR). D. Structure de la protéine BVP de Baculovirus (PDB : 1YN9).

Parmi les enzymes participant à la formation de la structure coiffe, les GTases restent les enzymes les moins bien caractérisées. L’étude des GTases chez le Chlorella virus (Figure 4A) et chez la levure (Figure 4B et 4C) démontre des homologies structurales importantes et a révélé la présence de deux domaines structuraux distincts : un domaine NTD du type nucleotidyl transferase (NT) et un domaine CTD homologue à celui des ligases à ADN [24]. Ces GTases sont caractérisées par un motif conservé KXDGI/L localisé 17 à 18 acides aminés en aval d’un motif riche en proline. La lysine catalytique forme un intermédiaire covalent avec le GMP avant de le transférer dans une seconde étape sur l’extrémité 5’ de l’ARN diphosphate. Bien que la capacité à former un lien covalent avec le GMP semble être une propriété de nombreuses GTases virales, le motif canonique KXDGI/L n’est pas strictement conservé [2].

Figure 4. Structures de GTases eucaryotes. Les structures des protéines sont représentées sous forme de rubans de couleur orange et les résidus impliqués dans la catalyse sont représentés sous forme de bâtons. Le code couleur des atomes des chaînes latérales est identique à celui de la Figure 3. Les trois premiers panneaux présentent des structures homologues. A. GTase Ceg-1 de S. cerevisiae (PDB : 3KYH) en conformation ouverte avant le recrutement du GTP. B. GTase Cgt-1 de C. Albicans en présence de GTP (PDB : 1P16) en conformation ouverte (correspondant à l’étape de recrutement du GTP). C. GTase de Chlorella virus en présence de GTP (PDB : 1CKM), en conformation fermée. D. GTase de Réovirus (PDB : 1EJ6, résidus 2 à 383), révélant un repliement alternatif aux GTases canoniques présentées en A, B et C.

Figure 4. Structures de GTases eucaryotes. Les structures des protéines sont représentées sous forme de rubans de couleur orange et les résidus impliqués dans la catalyse sont représentés sous forme de bâtons. Le code couleur des atomes des chaînes latérales est identique à celui de la Figure 3. Les trois premiers panneaux présentent des structures homologues. A. GTase Ceg-1 de S. cerevisiae (PDB : 3KYH) en conformation ouverte avant le recrutement du GTP. B. GTase Cgt-1 de C. Albicans en présence de GTP (PDB : 1P16) en conformation ouverte (correspondant à l’étape de recrutement du GTP). C. GTase de Chlorella virus en présence de GTP (PDB : 1CKM), en conformation fermée. D. GTase de Réovirus (PDB : 1EJ6, résidus 2 à 383), révélant un repliement alternatif aux GTases canoniques présentées en A, B et C.

Récemment, deux nouveaux repliements de GTases ont été identifiés chez les Orbivirus [13] et les Réovirus [25] (Figure 4D). L’activité GTase de ces deux protéines implique également la formation d’un lien covalent avec une molécule de GMP, mais la lysine catalytique a été identifiée uniquement chez les Réovirus.

Chez les Vésiculovirus et les Alphavirus (voir plus haut et Figure 2), il existe probablement des mécanismes catalytiques différents, mais ces enzymes n’ont pas été encore caractérisées d’un point de vue structural.

Les N7-MTases et/ou 2’O-MTases virales finalisent le processus de formation de la coiffe en synthétisant les structures coiffe-0 et coiffe-1. Chez les eucaryotes inférieurs, il n’y a pas de 2’O-méthylation de la coiffe, et seule la structure coiffe-0 a été décrite. Toutes les MTases impliquées dans la formation de la coiffe utilisent le SAM comme donneur de méthyl générant comme produit secondaire de réaction la molécule de SAH (S-adénosyl-L-homocystéine). Bien que les séquences primaires des différentes MTases soient très variables, leurs structures indiquent que leur cœur catalytique est organisé de manière très similaire (Figure 5). Il est dans tous les cas composé de sept feuillets β encadrés par des hélices α, formant une poche accommodant le SAM alors que des éléments structuraux additionnels assurent la reconnaissance spécifique des substrats.

Figure 5. Structures des N7- et 2’O-MTases. La figure montre les repliements de N7-MTases (A et B) et 2’O-MTases (C et D). Les structures des protéines sont représentées sous forme de rubans et le code couleur est identique à celui de la Figure 3. La surface transparente permet de visualiser les cavités des sites actifs. Les molécules d’analogues de SAM sont représentées au centre du site actif. A. N7-MTase de Encephalitozoon Cuniculi (PDB : 1Z3C) en présence d’un analogue du SAM. B. 2’O-MTase VP39 (PDB : 1AV6) du virus de la vaccine en complexe avec un ARNm et en présence de SAH. C. N7-MTase (protéine D1) du virus de la vaccine (PDB : 2VDW) en présence de SAH. D. N7- et 2’O-MTase (protéine NS5) du virus de la dengue (PDB : 2P3Q) en complexe avec un analogue de la structure coiffe et de SAH.

Figure 5. Structures des N7- et 2’O-MTases. La figure montre les repliements de N7-MTases (A et B) et 2’O-MTases (C et D). Les structures des protéines sont représentées sous forme de rubans et le code couleur est identique à celui de la Figure 3. La surface transparente permet de visualiser les cavités des sites actifs. Les molécules d’analogues de SAM sont représentées au centre du site actif. A. N7-MTase de Encephalitozoon Cuniculi (PDB : 1Z3C) en présence d’un analogue du SAM. B. 2’O-MTase VP39 (PDB : 1AV6) du virus de la vaccine en complexe avec un ARNm et en présence de SAH. C. N7-MTase (protéine D1) du virus de la vaccine (PDB : 2VDW) en présence de SAH. D. N7- et 2’O-MTase (protéine NS5) du virus de la dengue (PDB : 2P3Q) en complexe avec un analogue de la structure coiffe et de SAH.

La structure a été déterminée pour de nombreuses MTases cellulaires et virales impliquées dans la formation de la coiffe [13, 17, 26, 27]. Leurs structures correspondent au repliement canonique et révèlent (1) la présence d’un site spécifique de fixation du SAM à proximité immédiate des résidus catalytiques, (2) une poche permettant la fixation spécifique de la coiffe, et (3) un sillon capable d’accommoder l’ARN.

Les études structurales sur les complexes entre des 2’O-MTases et des ARNm ou des analogues de coiffe ont permis de mieux comprendre les mécanismes de reconnaissance des structures coiffe-0 par les 2’O-MTases (MTase de VP39 [3], VP4 [13] et NS5 [17]). En effet, les structures obtenues en présence d’analogues de coiffe indiquent que les molécules de ^7MeGpppN pénètrent dans une poche hydrophobe où elles sont maintenues par des résidus aromatiques. L’ARNm en aval de la coiffe se positionne dans une gorge chargée positivement de sorte que le groupement 2’-O du ribose du premier nucléotide de l’ARNm est localisé en face du donneur de méthyl. Le mécanisme catalytique implique une tétrade catalytique KDKE conservée [26] qui active le groupement 2’O du ribose et permet l’attaque nucléophile du groupement méthyl, et son transfert final sur la position 2’O du ribose [28].

Les bases moléculaires de la reconnaissance spécifique de la structure coiffe non méthylée en position N7 (GpppN) par les N7-MTases semblent différentes de celles déterminant la fixation du ^7MeGTP par les 2’O-MTases, suggérant un mécanisme catalytique spécifique. Dans ce cas, les structures de N7-MTases en complexe avec des ^7MeGpppARN [15, 29] indiquent que l’orientation optimale de la coiffe est assurée par un réseau d’interactions électrostatiques spécifiques qui positionnent le N7 du groupement guanylate à proximité immédiate du SAM.

Enfin, il est important de noter que des facteurs régulateurs de l’activité MTase (protéines virales jouant le rôle de cofacteur) ont été identifiés chez le VV et les Coronavirus [15, 30]. Le rôle physiologique de ces facteurs régulateurs, qui permettent l’activation de l’activité MTase, reste mal compris.

L’acquisition de la structure coiffe par les ARN messagers viraux est essentielle à la propagation de l’infection virale. Ainsi, elle permet l’expression des protéines virales par les ribosomes et limite la reconnaissance des ARN viraux par des sentinelles de l’immunité innée. Le rôle crucial de cette structure a notamment été démontré par des études de génétique inverse sur des enzymes virales impliquées dans la formation de la coiffe [2]. L’inhibition spécifique des enzymes de formation de la coiffe devrait par conséquent bloquer la réplication virale. Leur étude structurale et fonctionnelle a révélé des mécanismes originaux ouvrant la voie au développement de nouvelles stratégies antivirales.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts concernant les données publiées dans cet article.