La phosphorylation des protéines - un processus dynamique et réversible qui résulte de l’action coordonnée et antagoniste des enzymes qui phosphorylent - les protéine kinases - et qui déphosphorylent - les protéine phosphatases - représente un mécanisme clé pour la régulation de nombreuses voies de signalisation cellulaires. Environ 30 % des protéines sont phosphorylées sur les résidus d’acides aminés sérine/thréonine (ser/thr) par de ­nombreuses ser/thr kinases qui sont elles-mêmes spécifiquement régulées. La déphosphorylation des résidus ser/thr requiert un nombre restreint de sous-unités catalytiques de ser/thr phosphatases qui sont en revanche capables d’interagir avec une multitude de sous-unités régulatrices d’origine cellulaire ou virale, ce qui permet de générer une diversité d’holoenzymes. Au cours de la dernière décennie, différents travaux ont permis de mieux appréhender la régulation structurale et fonctionnelle des PP2A. Dans ce contexte, le ciblage des protéines PP2A par les protéines virales permet une meilleure compréhension des mécanismes de transformation cellulaire et pourrait offrir des pistes pour développer de nouvelles approches thérapeutiques contre le cancer.

La famille des phosphatases PP2A regroupe plusieurs holoenzymes qui jouent un rôle critique dans plusieurs processus cellulaires ­fondamentaux dont la régulation de la transcription, le contrôle du cycle cellulaire et du cytosquelette, de la survie cellulaire et du processus de transformation tumorale [ 1]. Dans cette famille d’enzymes, les sous-unités catalytique (C) et structurale (A) sont liées de façon constitutive. L’hétérodimère AC qui est aussi appelé le « core » est capable de s’associer à diverses sous-unités régulatrices de type B (B) et de former une enzyme fonctionnelle. La combinaison du core AC avec les différentes sous-unités de type B engendre un répertoire de nombreux holoenzymes qui est déterminant pour la spécificité et pour la régulation de l’activité de type 2A (Figure 1) [ 2]. Outre les sous-unités variables de type B, un nombre croissant de protéines cellulaires peut interagir avec une ou plusieurs sous-unités de PP2A pour s’associer à un holoenzyme spécifique. Plus de cinquante partenaires cellulaires ont ainsi été identifiés comme formant des complexes stables avec PP2A - des protéine kinases, des protéines du cytosquelette, des récepteurs et des facteurs de transcription - pour contrôler les principales voies de signalisation intracellulaire (Hox, Wnt, Ras, etc.) [ 3].

Figure 1. Structure des holoenzymes de PP2A. La famille des PP2A est constituée de plusieurs holoenzymes différentes. La sous-unité catalytique PP2AC, qui n’a jamais été retrouvée de façon isolée, est habituellement associée à la sous-unité structurale A ou, alternativement, à la protéine Tap42/α4. Les sous-unités A et C sont exprimées de manière constitutive alors que les sous-unités variables de type B (B/B'/B''/B''') inductibles sont impliquées dans la localisation subcellulaire de l’enzyme. Des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation et la méthylation des sous-unités catalytiques peuvent aussi moduler l’activité des PP2A dans la cellule. En particulier, la méthylation réversible, résultant de l’action coordonnée et antagoniste d’une leucine carboxyl méthyltransférase (LCMT) et d’une phosphatase méthylestérase (PME-1) spécifiques de PP2AC, régule la liaison des sous-unités variables de type B. De plus, la liaison de PTPA par le complexe inactif PP2A-PME-1 induit un changement conformationnel qui conduit à la formation d’un holoenzyme trimérique [1].

Figure 1. Structure des holoenzymes de PP2A. La famille des PP2A est constituée de plusieurs holoenzymes différentes. La sous-unité catalytique PP2AC, qui n’a jamais été retrouvée de façon isolée, est habituellement associée à la sous-unité structurale A ou, alternativement, à la protéine Tap42/α4. Les sous-unités A et C sont exprimées de manière constitutive alors que les sous-unités variables de type B (B/B'/B''/B''') inductibles sont impliquées dans la localisation subcellulaire de l’enzyme. Des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation et la méthylation des sous-unités catalytiques peuvent aussi moduler l’activité des PP2A dans la cellule. En particulier, la méthylation réversible, résultant de l’action coordonnée et antagoniste d’une leucine carboxyl méthyltransférase (LCMT) et d’une phosphatase méthylestérase (PME-1) spécifiques de PP2AC, régule la liaison des sous-unités variables de type B. De plus, la liaison de PTPA par le complexe inactif PP2A-PME-1 induit un changement conformationnel qui conduit à la formation d’un holoenzyme trimérique [1].

Les diverses protéines virales qui sont répertoriées dans le Tableau I (voir aussi [ 4– 16]) peuvent s’associer à des protéines PP2A et former des complexes fonctionnels plurimoléculaires capables de détourner la signalisation cellulaire en provoquant soit l’inhibition de PP2A, ce qui en général active la survie de l’hôte infecté, soit son activation, ce qui induit l’apoptose de l’hôte. Par exemple, les virus transformants à ADN de la famille des papovae codent pour des protéines comme la protéine transformante moyen T du virus polyome et les antigènes petit t des virus polyome ou SV40. Ces protéines virales sont capables de se substituer à certaines sous-unités régulatrices de type B pour interagir directement avec le core AC afin de réguler la réplication virale et la transformation cellulaire [ 13, 14]. Alternativement, et en contraste avec les antigènes de papovae, la protéine adénovirale E4orf4 se lie avec la sous-unité Bα de l’holoenzyme trimérique ABαC appelée PP2A₁ pour induire l’apoptose des cellules transformées ou infectées par les adénovirus (Figure 2) [4]. Par ailleurs, nous avons récemment montré que la séquence carboxy-terminale de la protéine Vpr du VIH (virus de l’immunodéficience humaine), qui lie la sous-unité A de l’holoenzyme PP2A₁, est un nouveau domaine biologiquement actif permettant de faire pénétrer la protéine Vpr entière et d’induire l’apoptose de ­différents types cellulaires [ 10].

Figure 2. La protéine phosphatase PP2A1 : une cible des protéines virales. L’holoenzyme trimérique PP2A1 est une cible élective de certaines protéines virales contenant une centaine d’acides aminés. Ces petites protéines virales sont, grâce leur association avec PP2A1, capables de fournir des signaux de prolifération cellulaire ou d’entrée en apoptose. Par exemple, les protéines transformantes, moyen T et petit t des virus polyome ou petit t de SV40, peuvent former des complexes trimériques actifs avec le core AC, en se substituant à la sous-unité régulatrice Bα [14]. De façon différente, la protéine virale E4orf4 induit l’apoptose des cellules transformées ou infectées par les adénovirus, grâce à sa liaison avec la sous-unité Bα de l’holoenzyme PP2A1 [4], alors que la protéine Vpr du VIH-1 interagit avec la sous-unité A de PP2A1 pour induire une apoptose de différentes cellules [10].

Figure 2. La protéine phosphatase PP2A1 : une cible des protéines virales. L’holoenzyme trimérique PP2A1 est une cible élective de certaines protéines virales contenant une centaine d’acides aminés. Ces petites protéines virales sont, grâce leur association avec PP2A1, capables de fournir des signaux de prolifération cellulaire ou d’entrée en apoptose. Par exemple, les protéines transformantes, moyen T et petit t des virus polyome ou petit t de SV40, peuvent former des complexes trimériques actifs avec le core AC, en se substituant à la sous-unité régulatrice Bα [14]. De façon différente, la protéine virale E4orf4 induit l’apoptose des cellules transformées ou infectées par les adénovirus, grâce à sa liaison avec la sous-unité Bα de l’holoenzyme PP2A1 [4], alors que la protéine Vpr du VIH-1 interagit avec la sous-unité A de PP2A1 pour induire une apoptose de différentes cellules [10].

PP2A régule de nombreuses voies de signalisation comme Wnt, PI3K/Akt, et c-Myc, qui sont impliquées dans le processus de transformation tumorale [3]. Plusieurs mécanismes impliquant des mutations génétiques des sous-unités de PP2A [3], la dérégulation de la méthylation de la sous-unité PP2Ac [ 17] ou la surexpression d’inhibiteurs spécifiques [ 18] aboutissent à l’inhibition de PP2A (Figure 3A). En particulier, divers travaux ont permis l’identification de plusieurs protéines oncogéniques comme le facteur CIP2A (cancerous inhibitor of PP2A), un inhibiteur spécifique de PP2A qui est surexprimé dans divers types de cancer humains et qui, en inhibant PP2A, empêche la déphosphorylation de c-Myc et prévient ainsi sa dégradation [18, 19]. La surexpression de CIP2A est aussi induite par la protéine oncogénique CagA d’Helicobacter pylori, l’agent étiologique du cancer gastrique [ 20]. Par ailleurs, SET/(I2^PP2A), un autre inhibiteur de PP2A qui est surexprimé en présence de l’oncogène BCR/ABL¹, est impliqué dans la leucémie myéloïde chronique [ 21]. D’autres inhibiteurs cellulaires endogènes comme la protéine α4 sont surexprimés dans des cancers humains et contribuent au développement du processus tumoral [ 22]. De façon remarquable, des protéines virales ­transformantes peuvent inhiber PP2A pour induire le processus tumoral en mimant l’effet des inhibiteurs cellulaires de PP2A (Figure 3B) [1].

Figure 3. L’inhibition de PP2A induit un signal tumoral. A. PP2A régule négativement des signaux anti-apoptotiques comme la voie de signalisation PI3K/Akt. Ceux-ci, à la suite de l’inhibition de PP2A, sont activés dans la transformation tumorale [3]. Parmi les mécanismes impliquant l’inhibition de PP2A dans le processus de transformation tumorale, on trouve : 1. Des mutations génétiques de la sous-unité structurale A diminuant l’activité PP2A qui ont été caractérisées dans plusieurs types de cancers humains [3]. 2. La troncation de la sous-unité régulatrice PR61/B’γ qui induit la radiorésistance et active le processus métastatique [2]. 3. La dérégulation de la méthylation de PP2A [17] et la surexpression d’inhibiteurs spécifiques de PP2A comme SET, CIP2A ou α4 [18, 19]. B. PP2A l’antigène petit t de SV40 (Ag petit t) : un exemple de la dérégulation des signaux de survie contrôlés par PP2A qui provoque la transformation tumorale. L’inhibition de PP2A par l’antigène petit t de SV40 déplace la sous-unité B′/B56/PR61γ, ce qui a pour conséquence d’activer les voies de signalisation PI3K/Akt, Wnt, et c-Myc impliquées dans les processus tumoraux [1].

Figure 3. L’inhibition de PP2A induit un signal tumoral. A. PP2A régule négativement des signaux anti-apoptotiques comme la voie de signalisation PI3K/Akt. Ceux-ci, à la suite de l’inhibition de PP2A, sont activés dans la transformation tumorale [3]. Parmi les mécanismes impliquant l’inhibition de PP2A dans le processus de transformation tumorale, on trouve : 1. Des mutations génétiques de la sous-unité structurale A diminuant l’activité PP2A qui ont été caractérisées dans plusieurs types de cancers humains [3]. 2. La troncation de la sous-unité régulatrice PR61/B’γ qui induit la radiorésistance et active le processus métastatique [2]. 3. La dérégulation de la méthylation de PP2A [17] et la surexpression d’inhibiteurs spécifiques de PP2A comme SET, CIP2A ou α4 [18, 19]. B. PP2A l’antigène petit t de SV40 (Ag petit t) : un exemple de la dérégulation des signaux de survie contrôlés par PP2A qui provoque la transformation tumorale. L’inhibition de PP2A par l’antigène petit t de SV40 déplace la sous-unité B′/B56/PR61γ, ce qui a pour conséquence d’activer les voies de signalisation PI3K/Akt, Wnt, et c-Myc impliquées dans les processus tumoraux [1].

Les virus disposent d’un petit génome codant pour un nombre restreint de protéines capables de cibler des effecteurs cellulaires importants dont PP2A. Lors des deux dernières décennies, des études basées sur l’inter­action fonctionnelle de PP2A avec des protéines ­virales ont permis d’identifier des voies de signalisation critiques pour la biologie des virus et pour l’induction des processus tumoraux. En particulier, l’identification d’oncoprotéines virales (l’antigène petit t de SV40) a permis de caractériser un mécanisme précis impliquant l’inhibition de PP2A dans un processus de transformation tumorale (Figure 3B) [2]. Par ailleurs, l’identification de protéines virales proapoptotiques, comme la protéine adénovirale E4orf4 ou la protéine Vpr du VIH-1 ( Figure 2 et [10]), a suggéré de nouvelles pistes pour identifier des signalisations antiapoptotiques et antitumorales. De façon intéressante, la protéine E4orf4 codée par les adénovirus provoque l’apoptose des ­cellules infectées, ce qui permettrait de libérer les nouveaux virions, mais elle entraîne aussi la mort des cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales [4]. Les étapes précoces de l’infection par des adénovirus se caractérisent par la transcription de gènes viraux précoces (appelés E1) codant pour des protéines oncogéniques qui activent la division cellulaire (E1A) et inactivent p53 et la machinerie apoptotique (E1B55K et E1B19K). L’infection par l’adénovirus favorise donc la réplication de l’ADN viral tout en créant un contexte cellulaire similaire à celui d’une cellule transformée dans laquelle les mécanismes apoptotiques, par exemple ceux que contrôle p53, sont inhibés. Dans ces conditions, l’induction de l’apoptose des cellules cancéreuses, qui requiert une interaction spécifique de la protéine E4orf4 avec la sous-unité Bα de l’holoenzymze PP2A₁ (Figure 2), ne nécessite pas la présence d’un gène p53 fonctionnel [ 23]. Le signal contrôlé par E4orf4 et par PP2A₁ représente donc une cible d’action très prometteuse pour un développement potentiel d’une chimiothérapie non toxique [ 24]. Dans ce sens, une première approche a tenté de reproduire le signal antitumoral de E4orf4, et a montré que le transfert de l’ADNc de E4orf4 par électroporation inhibe la croissance du mélanome murin B16. Cependant, cet effet ne se révèle pas suffisamment efficace pour un traitement thérapeutique [ 25].

Par ailleurs, une approche pharmacologique antitumorale basée sur la dérégulation, par des petites molécules chimiques ou peptidiques, de complexes fonctionnels associés à PP2A a été proposée. Par exemple, l’utilisation de FTY720, un immunosuppresseur qui active PP2A et inhibe la voie de survie PI3K/Akt, a été proposée dans le traitement de la leucémie myéloïde [ 26]. Dans ce contexte, l’inhibition de PP2A par l’antigène petit t de SV40 contrecarre l’effet d’activation de PP2A par le FTY720 et maintient l’activité d’Akt [ 27]. Ce résultat illustre bien un des prérequis de ces approches : les agents pharmacologiques doivent avoir une très haute affinité pour les sous-unités de PP2A qui sont ciblées, de façon à pouvoir contrecarrer efficacement la liaison à PP2A d’oncogènes cellulaires ou viraux. Dans ce contexte, nous avons proposé une approche thérapeutique appelée drug phosphatase technology, ou DPT, basée sur l’inhibition de processus pathologiques par transfert intracellulaire de peptides pénétrants mimant des sites d’interaction avec des protéines de la famille des protéine phosphatases PP1/PP2A (Figure 4) [ 28]. En particulier, nous avons caractérisé DPT-5, un peptide pénétrant contenant, à l’instar d’E4orF4, une séquence d’interaction (dans ce cas issue de l’antigène CD28) avec la sous-unité Bα de PP2A₁, qui induit l’apoptose des cellules humaines [28]. Plus récemment, nous avons montré qu’un peptide DPT contenant un site de liaison de la protéine E4orf4 de chien qui interagit avec la sous-unité structurale Bα de PP2A₁ provoque l’apoptose des cellules tumorales humaines sans affecter les cellules saines (Galioot et al., en préparation).

Figure 4. Le concept DPT : dérégulation ciblée et spécifique des protéine phosphatases PP1/PP2A pour induire l’apoptose de la cellule tumorale. Nous avons caractérisé un nouveau peptide pénétrant de localisation cytoplasmique qui mime la séquence du site de liaison de la protéine CK2α avec la sous-unité A de PP2A. Ce peptide appelé DPTsh1 est une navette non toxique qui permet d’introduire dans les cellules en culture des séquences apoptotiques impliquées dans l’interaction avec PP1/PP2A. En particulier, une séquence d’interaction de la protéine apoptotique Bad avec PP1c, ou de l’antigène CD28 avec PP2A1, provoquent l’apoptose des cellules humaines [28]. Plus récemment, nous avons caractérisé DPT-AIF1, une nouvelle séquence pénétrante, issue du domaine carboxy-terminal de la protéine apoptotique AIF (apoptosis inducing factor) qui se lie à la protéine PP1c pour induire l’apoptose. DPT-AIF1, qui contient le motif (RK)-x(0,1)-V/I-x-F-x-x-(RK)-x-(RK) présent également dans une dizaine de protéines impliquées dans la survie des cellules, est une nouvelle signature apoptotique permettant l’association avec PP1. Ce motif pourrait être utilisé pour concevoir de nouvelles molécules peptidiques au potentiel thérapeutique [ 29].

Figure 4. Le concept DPT : dérégulation ciblée et spécifique des protéine phosphatases PP1/PP2A pour induire l’apoptose de la cellule tumorale. Nous avons caractérisé un nouveau peptide pénétrant de localisation cytoplasmique qui mime la séquence du site de liaison de la protéine CK2α avec la sous-unité A de PP2A. Ce peptide appelé DPTsh1 est une navette non toxique qui permet d’introduire dans les cellules en culture des séquences apoptotiques impliquées dans l’interaction avec PP1/PP2A. En particulier, une séquence d’interaction de la protéine apoptotique Bad avec PP1c, ou de l’antigène CD28 avec PP2A1, provoquent l’apoptose des cellules humaines [28]. Plus récemment, nous avons caractérisé DPT-AIF1, une nouvelle séquence pénétrante, issue du domaine carboxy-terminal de la protéine apoptotique AIF (apoptosis inducing factor) qui se lie à la protéine PP1c pour induire l’apoptose. DPT-AIF1, qui contient le motif (RK)-x(0,1)-V/I-x-F-x-x-(RK)-x-(RK) présent également dans une dizaine de protéines impliquées dans la survie des cellules, est une nouvelle signature apoptotique permettant l’association avec PP1. Ce motif pourrait être utilisé pour concevoir de nouvelles molécules peptidiques au potentiel thérapeutique [ 29].

En conclusion, le ciblage des protéine phosphatases PP2A par des protéines virales apparaît comme une stratégie importante pour le contrôle des processus infectieux et tumoraux. L’inhibition de PP2A par les protéines virales codées par des virus transformants de type papovae s’oppose à l’activation de PP2A par des ­protéines virales proapoptotiques (E4orf4 ; VIH-1 Vpr). L’identification de nouvelles protéines virales utilisant le système PP2A pour déréguler les cellules permettrait une meilleure caractérisation des mécanismes de transformation cellulaire. L’étude approfondie de ces mécanismes et la conception de molécules capables de contrecarrer les signaux tumoraux restent un défi pour la recherche biomédicale.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts concernant les données publiées dans cet article.

Les auteurs remercient l’Institut Pasteur et l’Inra qui ont soutenu leur recherche.