La notion de cellule souche date de plus d’un siècle. L’Allemand F.E.C. Neumann (1834-1918) a été le premier à postuler à la fin du xix ^e siècle que la moelle osseuse était l’organe de formation du sang. Il a également proposé une théorie, controversée à l’époque, selon laquelle une cellule souche pourrait être à l’origine de toutes les lignées sanguines. Cette théorie fondatrice de l’existence de cellules souches hématopoïétiques (CSH) a depuis été validée. Les CSH ont la capacité de s’autorenouveler, ce qui permet de maintenir constant leur nombre durant toute la vie d’un individu. Elles ont également la capacité de donner naissance à toutes les cellules hématopoïétiques matures circulantes, via la production de progéniteurs qui se différencient à leur tour en cellules des lignées myéloïdes et lymphoïdes. Les progéniteurs, contrairement aux CSH, ne s’autorenouvellent pas. Les CSH sont donc à l’origine de la fabrication continue et régulée des cellules sanguines indispensables à la vie.

Les CSH constituent l’élément-clé des greffons utilisés à des fins thérapeutiques : la moelle osseuse, le sang périphérique après mobilisation des cellules médullaires¹ et le sang de cordon ombilical sont des sources de CSH utilisées pour les transplantations dans les déficits constitutionnels ou acquis du tissu hématopoïétique, les hémopathies (par exemple : leucémies) ou comme adjuvant dans le traitement des tumeurs solides. Les CSH sont toutefois en quantité très restreinte, ce qui limite considérablement leur étude et leur utilisation. Malgré une connaissance de plus en plus précise de la régulation des CSH, notamment chez l’adulte, il est toujours très difficile de reproduire in vitro les conditions appropriées à leur survie et leur expansion sans induire leur différenciation ou leur transformation maligne. Il est également impossible de générer efficacement des CSH in vitro, y compris à partir de cellules souches embryonnaires (CSE) ou de cellules souches pluripotentes reprogrammées (iPS, induced pluripotent stem). Une connaissance plus approfondie de l’origine des CSH adultes, ainsi que des mécanismes régulateurs contrôlant leurs production, survie et expansion, reste donc toujours d’actualité et d’une grande importance tant d’un point de vue fondamental que clinique.

Bien que localisées dans la moelle osseuse chez l’adulte, les CSH ne sont pas originaires de ce tissu. D’origine mésodermique, elles émergent durant la vie embryonnaire, période pendant laquelle elles transitent par plusieurs sites hématopoïétiques avant de finalement coloniser la moelle osseuse avant la naissance [ 1, 2]. Étudier la mise en place du système hématopoïétique au cours du développement est essentiel, car contrairement au microenvironnement médullaire adulte, l’embryon pourvoit un microenvironnement singulier permettant non seulement la production, mais également l’expansion massive des CSH.

Les premières cellules hématopoïétiques commencent à apparaître dans le sac vitellin (SV), tissu extraembryonnaire, à partir du jour embryonnaire (E) 7-7,5 du développement de la souris [ 3]. De petits agrégats de cellules initialement homogènes forment progressivement des structures, appelées îlots sanguins, qui sont constituées de larges érythrocytes nucléés entourés d’une couche de cellules endothéliales. Les deux types de cellules, hématopoïétiques et endothéliales, ont ainsi dans le SV un précurseur commun appelé hémangioblaste [ 4]. Des cellules matures (macrophages, mégacaryocytes) et des progéniteurs ayant un potentiel de différenciation lympho-myéloïde varié sont également produits in situ [3, 5]. Dans les années 1970, le dogme suivant lequel les CSH étaient probablement aussi originaires du SV était donc logique et assez consensuel. Toutefois, l’analyse de l’émergence de l’hématopoïèse dans des modèles non-mammifères a remis ce dogme en question. En effet, les travaux pionniers effectués sur l’embryon d’oiseau, et notamment la création de chimères dans lesquelles un embryon de caille était greffé sur un SV de poulet après excision de l’embryon de poulet, ont clairement démontré que les CSH avaient une origine intraembryonnaire, et plus précisément restreinte à la région de l’aorte [ 6]. Ces résultats ont été confirmés chez l’embryon d’amphibien en utilisant une approche similaire [ 7]. Il est ainsi apparu que la production hématopoïétique dans le SV, initialement indispensable à la survie et au bon développement de l’embryon, n’est que transitoire et ne participe pas à l’hématopoïèse adulte.

Des greffes similaires sont techniquement irréalisables chez les embryons de mammifères en raison de leur développement intra-utérin. L’identification des CSH de mammifères nécessite un test in vivo consistant à injecter par voie veineuse les cellules à tester dans des souris hôtes adultes irradiées. La présence de CSH dans le greffon est responsable d’une reconstitution hématopoïétique multilignée (lignées lymphoïdes et myéloïdes) à long terme (ce terme définit un délai au-delà de 4 mois) originaire du donneur. Des transplantations secondaires (utilisant comme greffon la moelle du receveur primaire) sont également effectuées pour tester la capacité d’autorenouvellement des cellules à tester. Plus de vingt ans après les travaux réalisés chez l’oiseau, la présence de CSH a été testée dans différents tissus murins d’origine intra- ou extraembryonnaire. Il a ainsi été suggéré que les CSH avaient également une origine intraembryonnaire chez les mammifères. Les premières CSH sont ainsi détectées dans l’aorte dorsale de l’embryon de souris (région aorte-gonade-mésonéphros ou AGM) à partir de E10,5 [ 8– 10]. Les CSH sont également présentes dans les artères vitellines et ombilicales et, un jour plus tard, dans le sac vitellin, le placenta et le foie fœtal (> E11-11,5) [10– 12]. C’est dans ces deux derniers sites que les CSH vont proliférer pour constituer un stock suffisant de cellules souches qui coloniseront la moelle osseuse en fin de gestation. L’analyse histologique d’embryons au stade où les premières cellules hématopoïétiques commencent à être détectées a révélé la présence d’amas de cellules attachés à l’endothélium ventral de l’aorte et des artères vitellines et ombilicales, ainsi que dans le labyrinthe vasculaire du placenta [ 13]. Ces amas cellulaires ou clusters sont détectés dans de très nombreuses espèces [ 14]. Les cellules des clusters coexpriment des marqueurs hématopoïétiques (par exemple c-kit [récepteur du stem cell factor], CD41 [glycoprotéine IIb-IIIa plaquettaire]) et endothéliaux (par exemple CD31 [ou PECAM, platelet endothelial cell adhesion molecule], Tie-2 [récepteur de l’angiopoïétine]) [ 15]. De plus, ces clusters sont totalement absents dans les embryons présentant un défaut hématopoïétique (par exemple les mutants dépourvus du facteur de transcription Runx1 [ 16]). Ces observations ont conduit à la conclusion que les CSH résidaient probablement dans ces clusters intra-artériels. Des clusters extravasculaires formés de cellules hématopoïétiques entourées de cellules endothéliales (similaires aux îlots sanguins du sac vitellin) ont également été observés lors du remodelage de l’artère vitelline en milieu de gestation [ 17]. Toutefois, le rôle et la composition hématopoïétique exacte de ces clusters restent incertains.

Il est maintenant bien établi que les CSH adultes dérivent d’une population endothéliale hémogénique. Toutefois, l’origine anatomique des CSH reste incertaine du fait de la mise en place de la circulation entre les sites intra- et extraembryonnaires dès E8,5. Les cellules endothéliales hémogéniques sont indiscernables des cellules endothéliales non hémogéniques. De plus, il est impossible de cibler spécifiquement les cellules endothéliales d’un site hématopoïétique donné. Donc, si des cellules endothéliales hémogéniques sont présentes dans plusieurs sites hématopoïétiques, tous ces sites ont en théorie la capacité de produire des CSH. Il a été démontré que le sac vitellin et le placenta (allantoïde et chorion) disséqués avant la mise en place de la circulation sanguine (avant  E8,5) ou issus d’embryons Ncx1^-/- (dont le cœur ne bat pas en raison de l’inactivation de l’échangeur Na/Ca et qui de ce fait meurent avant E10) étaient capables de donner naissance de novo à des progéniteurs hématopoïétiques [5, 13, 27, 28]. La preuve formelle n’est toujours pas établie en ce qui concerne les CSH, car les tissus ont été testés avant E10,5. Donc, la question d’une origine anatomique multiple des CSH reste toujours d’actualité.

Naissance en direct des cellules hématopoiétiques à partir des cellules endothéliales dans l’embryon de souris

Appliquer la technique d’imagerie in vivo à l’embryon de souris est nettement plus ardu. En effet, un obstacle majeur est que les techniques de microscopie confocale actuelles ne permettent pas une pénétration suffisante pour visualiser l’aorte située profondément dans l’embryon de souris. De plus, l’embryon est opaque et se développe in utero. Nous avons récemment mis au point deux techniques de dissection d’embryons de souris afin d’accéder à l’aorte [15] (Figure 3) . Les embryons (E10,5) sont isolés puis disséqués afin de séparer le tronc de la tête et de la queue. Les troncs sont ensuite sectionnés transversalement en coupes épaisses de  200 µm (Figure 3 , technique 1). Dans une deuxième approche, les tissus dorsaux comprenant les somites et le tube neural sont séparés du tronc afin de visualiser l’aorte située sous les somites (Figure 3 , technique 2). Nous avons utilisé des embryons transgéniques Ly-6A(Sca-1)-GFP (les CSH de l’embryon et de l’adulte sont exclusivement contenues dans la fraction GFP⁺ ; certaines cellules endothéliales sont également GFP⁺ ) [ 34] et des embryons knock-in CD41-YFP (CD41 étant considéré comme le premier marqueur d’engagement dans la lignée hématopoïétique) [ 35– 37]. Afin de marquer l’endothélium (incluant les cellules endothéliales hémogéniques), nous avons injecté des anticorps anti-CD31 couplés à des fluorochromes directement dans l’aorte. Les embryons disséqués ou les coupes d’embryons ont ensuite été suivis par vidéomicroscopie confocale et photographiés à intervalles réguliers durant des périodes allant jusqu’à 15 h. Dans ces conditions, nous avons observé l’émergence, dans la lumière de l’aorte, de cellules hématopoïétiques coexprimant CD31 et Ly-6A-GFP, ou CD31 et CD41-YFP. Le fait qu’après leur émergence les cellules soient toujours marquées avec les anticorps anti-CD31, alors que le marquage avait été réalisé avant le début de l’imagerie, prouve sans ambiguïté leur origine endothéliale. Nous avons observé que le signal YFP (CD41) ne s’allume qu’au moment de l’émergence des cellules, ce qui prouve leur engagement dans la voie hématopoïétique. Nous avons marqué de nouveau les sections (après imagerie) avec des anticorps anti-c-kit (un marqueur classique des CSH) : toutes les cellules nouvellement formées expriment c-kit. La production de ces cellules est très faible, nous l’avons estimée à environ deux cellules par aorte. Par comparaison, la production hématopoïétique dans l’aorte de l’embryon de poisson zèbre est beaucoup plus élevée, estimée à trois cellules par aorte et par heure [31]. Si l’hématopoïèse adulte a clairement pour origine ces cellules dérivées de ­l’endothélium hémogénique, il est difficile de savoir si toutes les cellules qui émergent dans l’aorte de l’embryon de poisson sont des CSH. Au contraire, dans l’embryon de souris, le nombre de cellules que l’on voit émerger dans l’aorte, bien que très faible, correspond au nombre de CSH estimé par aorte à E10,5 (déterminé par le calcul statistique après des expériences de reconstitution hématopoiétique avec des concentrations décroissantes de cellules) [ 38]. Aucune émergence de cellules hématopoiétiques n’a été observée à partir des cellules endothéliales dans les coupes d’embryons Runx1^-/- , ou dans des embryons normaux disséqués avant E10,5. De plus, la transition cellules endothéliales hémogéniques en cellules hématopoïétiques a toujours été observée dans le plancher de l’aorte, où l’activité CSH est circonscrite [ 39]. Nous avons démontré par technique d’imagerie sur coupe d’embryons non fixés que des cellules endothéliales hémogéniques situées dans le plancher de l’aorte pouvaient donner naissance à des cellules hématopoïétiques à partir de E10,5 et de façon polarisée (vers la lumière de l’aorte) : il est vraisemblable qu’il s’agisse de CSH, bien qu’il soit actuellement techniquement impossible de transplanter ces cellules pour analyser leur fonctionnalité [ 40] (Figure 2C) .

Figure 3. Techniques permettant de visualiser l’aorte d’embryon de souris par microscopie confocale. Afin de visualiser l’aorte, qui est localisée profondément dans l’embryon de souris, deux protocoles de dissection ont été développés [15]. Le tronc de l’embryon non fixé est séparé de la tête et de la queue. L’endothélium et les clusters hématopoïétiques sont marqués grâce à l’injection à l’intérieur de l’aorte d’anticorps fluorescents spécifiques. Dans la technique 1 (T1), le tronc de l’embryon est coupé transversalement pour former des coupes d’une épaisseur de  200 μm. Dans la technique 2 (T2), les tissus dorsaux (les somites et le tube neural) sont séparés du reste du tronc afin de mettre à jour l’aorte qui est localisée juste derrière les somites [40].

Figure 3. Techniques permettant de visualiser l’aorte d’embryon de souris par microscopie confocale. Afin de visualiser l’aorte, qui est localisée profondément dans l’embryon de souris, deux protocoles de dissection ont été développés [15]. Le tronc de l’embryon non fixé est séparé de la tête et de la queue. L’endothélium et les clusters hématopoïétiques sont marqués grâce à l’injection à l’intérieur de l’aorte d’anticorps fluorescents spécifiques. Dans la technique 1 (T1), le tronc de l’embryon est coupé transversalement pour former des coupes d’une épaisseur de  200 μm. Dans la technique 2 (T2), les tissus dorsaux (les somites et le tube neural) sont séparés du reste du tronc afin de mettre à jour l’aorte qui est localisée juste derrière les somites [40].

En conclusion, un nombre important d’études, effectuées in vitro et in vivo dans des modèles animaux aussi différents que l’oiseau, le poisson et la souris, ont maintenant démontré l’origine endothéliale embryonnaire des CSH adultes. L’observation directe et en temps réel de l’émergence de ces cellules a fourni la preuve définitive par l’image que des CSH étaient produites dans l’aorte à partir d’une population de cellules endothéliales hémogéniques situées dans le plancher de l’aorte. Cette production aortique n’est pas incompatible avec la possibilité que des CSH soient aussi produites dans d’autres sites hématopoïétiques comme le placenta et le sac vitellin. Bien que difficile techniquement, l’utilisation de l’imagerie confocale en temps réel sur ces tissus extra-embryonnaires permettrait de répondre directement à cette question. De manière surprenante, le mécanisme d’émergence des CSH dans l’aorte est très différent dans l’embryon de poulet et de poisson zèbre (Figure 2AB) , et est encore largement méconnu dans l’embryon de souris (Figure 2C) . Ces différences ne permettent pas de présumer du mécanisme d’émergence des CSH dans l’embryon humain. Enfin, un point crucial à élucider serait de déterminer comment les CSH nouvellement produites à partir d’un endothélium apparemment mature acquièrent leurs propriétés de cellules souches ; c’est une condition sine qua non à l’établissement de conditions de culture compatibles avec la production in vitro de CSH.

Catherine Robin et Jean-Charles Boisset reçoivent le soutien de NWO (Vidi Dutch young investigator grant [917-76-345]).