L’utilisation de plus en plus fréquente des ARNnc, et en particulier des miARN, en tant qu’outils de diagnostic ou de thérapie est toutefois limitée par de nombreuses difficultés techniques. De nombreux miARN sont observés de façon stable dans différents fluides biologiques comme le sang ou l’urine et peuvent ainsi être utilisés comme marqueurs diagnostiques [ 3]. Des miARN foetaux circulant dans le sang maternel peuvent même permettre de détecter une grossesse chez la femme [3]. De manière encore plus cruciale, l’expression de nombreux miARN étant dérégulée en cas de cancer [ 4, 13, 14], leur identification dans le sang permet des diagnostics de plus en plus précis. Par exemple, la restriction de l’expression de plusieurs miARN à des tissus précis peut renseigner sur l’origine de la tumeur primaire en cas de métastases, ce qui est indispensable à la mise en place du traitement adéquat [ 5].

L’ensemble de ces approches diagnostiques a notamment bénéficié des progrès récents des nouvelles techniques de séquençage à haut-débit, très sensibles, et qui peuvent conduire actuellement à obtenir des millions de séquences en une seule expérience, permettant même la détection de miARN très peu abondants. Le point crucial, et souvent limitant, de ces approches à haut-débit demeure toutefois l’étape de génération des banques d’ARN à séquencer [ 6].

Chez les eucaryotes, la grande majorité, si ce n’est la totalité des ARNnc fonctionnels sont contenus dans des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) de grande taille. Dans ces complexes, la molécule d’ARN peut être associée à différentes protéines qui se lient à l’ARN pour former des microRNP (avec des miARN) ou des petites RNP nucléolaires (avec des petits ARN nucléolaires ou snoARN). Afin de distinguer, parmi l’ensemble des transcrits présents dans la cellule, ceux qui sont fonctionnels et biologiquement actifs de ceux qui ne le sont pas, une nouvelle approche de génération de banques d’ADN complémentaires (ADNc) des ARNnc [ 7, 8].

Jusqu’alors, ce type de banques était généré à partir d’ARN nus extraits au phénol-chloroforme et séparés sur gel de polyacrylamide dénaturant, ce qui permettait une sélection selon leur taille des molécules à inclure dans la banque [ 9, 10]. Toutefois, l’inconvénient majeur de ces banques était qu’elles contenaient de façon majoritaire des produits de dégradation non fonctionnels d’ARN ribosomiques ou d’ARN messagers, parfois dans des proportions supérieures à 90 % [10], masquant et empêchant ainsi, lors du séquençage, l’identification de nouvelles molécules plus rares.

Notre nouvelle approche est basée sur la sélection de RNP en conditions natives sur gradient de glycérol en amont de l’étape d’isolement des ARN (Figure 1), ce qui permet d’enrichir les banques en ARN fonctionnels inclus dans des RNP, contrairement à l’approche traditionnelle, et d’identifier de nouveaux ARNnc régulateurs [7]. La comparaison des séquences obtenues pour deux banques d’ARNnc issus de cerveaux de souris préparées selon les deux approches est sans ambiguïté (Figure 2). Alors que près de la moitié des séquences obtenues avec une approche classique correspondent à des fragments d’ARN ribosomiques non fonctionnels [9], ce pourcentage n’est que de 2 % avec l’approche par sélection des RNP, ce qui a permis d’obtenir 98 % d’ARNnc fonctionnels dans la banque [7]. Par une approche à haut-débit, le séquençage de cette banque a en outre permis d’identifier environ un millier de nouveaux candidats petits ARNnc dont la caractérisation fonctionnelle est en cours [7].

Figure 1 Principe de l’enrichissement en particules ribonucléoprotéiques . La sélection de particules ribonucléoprotéiques (RNP) sur gradient de glycérol permet d’enrichir les banques qui en résultent en ARN fonctionnels. En effet, seuls les ARN associés à des protéines au sein des RNP, et dont la probabilité d’être des ARN fonctionnels est ainsi accrue, sont analysés. Les ARN dégradés non associés à des protéines ou les sousunités ribosomiques que l’on trouve au sommet du gradient ou dans le culot respectivement, sont exclus du processus, ce qui permet d’éviter qu’ils soient ensuite séquencés en majorité. Adapté avec la permission de [7].

Figure 1 Principe de l’enrichissement en particules ribonucléoprotéiques . La sélection de particules ribonucléoprotéiques (RNP) sur gradient de glycérol permet d’enrichir les banques qui en résultent en ARN fonctionnels. En effet, seuls les ARN associés à des protéines au sein des RNP, et dont la probabilité d’être des ARN fonctionnels est ainsi accrue, sont analysés. Les ARN dégradés non associés à des protéines ou les sousunités ribosomiques que l’on trouve au sommet du gradient ou dans le culot respectivement, sont exclus du processus, ce qui permet d’éviter qu’ils soient ensuite séquencés en majorité. Adapté avec la permission de [7].

Figure 2 Séquençage de deux banques d’ARN non codants de cerveau de souris. A. Distribution des 31 882 séquences obtenues par séquençage à haut-débit d’une banque préparée selon l’approche RNP à partir de cellules de cerveau murin [7]. Les proportions d’ADNc correspondant aux différentes catégories d’ARNnc sont rapportées au nombre total de séquences. B. Distribution des séquences de 800 clones choisis au hasard et issus d’une banque d’ADNc classique préparée à partir d’ARN nus de tailles comprises entre 50 et 500 nucléotides [9]. Les proportions d’ADNc correspondant aux différentes catégories d’ARNnc sont rapportées au nombre total de séquences. ARNr, ARN ribosomique ; ARNt, ARN de transfert ; miARN, microARN ; snoARN, petit ARN nucléolaire ; ARNsn, petit ARN nucléaire. La proportion d’ARNr pour la même banque atteint 72% si des ARN de tailles comprises entre 110 et 500 nucléotides sont utilisés. Reproduit avec la permission de [8].

Figure 2 Séquençage de deux banques d’ARN non codants de cerveau de souris. A. Distribution des 31 882 séquences obtenues par séquençage à haut-débit d’une banque préparée selon l’approche RNP à partir de cellules de cerveau murin [7]. Les proportions d’ADNc correspondant aux différentes catégories d’ARNnc sont rapportées au nombre total de séquences. B. Distribution des séquences de 800 clones choisis au hasard et issus d’une banque d’ADNc classique préparée à partir d’ARN nus de tailles comprises entre 50 et 500 nucléotides [9]. Les proportions d’ADNc correspondant aux différentes catégories d’ARNnc sont rapportées au nombre total de séquences. ARNr, ARN ribosomique ; ARNt, ARN de transfert ; miARN, microARN ; snoARN, petit ARN nucléolaire ; ARNsn, petit ARN nucléaire. La proportion d’ARNr pour la même banque atteint 72% si des ARN de tailles comprises entre 110 et 500 nucléotides sont utilisés. Reproduit avec la permission de [8].

L’obtention de banques à partir des RNP constitue donc une bonne alternative aux protocoles existants, et permet une étude du transcriptome par des approches de séquençage à haut-débit (technologie RNAseq) [8]. Ces approches par séquencage tendent même à dépasser aujourd’hui les approches d’analyse transcriptomique à l’aide des micropuces à ADN qui constituaient la méthode de choix au cours de ces dernières années. En effet, ces dernières approches, bien qu’extrêmement informatives, ne permettent toujours pas l’identification de nouveaux ARNnc, puisqu’elles sont basées sur la connaissance a priori des séquences à étudier qui doivent être déposées sur la puce.