Afin de répondre à ces contraintes, nous avons récemment publié une nouvelle approche pour induire la différenciation des CSEh en hépatocytes. Celle-ci utilise des conditions chimiquement définies et suit les étapes clefs du développement hépatique [ 7] (Figures 1 et 2).

Les trois étapes sont identiques à celles précédemment définies.

• Induction des CSEh pluripotentes en cellules de l’endoderme définitif. Cette étape est contrôlée par une combinaison de 4 facteurs, nécessaires mais suffisants, utilisée pendant 3 jours : concentration élevée d’activine A, de BMP4 et de FGF2, facteurs connus pour contrôler la spécification des 3 lignées germinales chez les mammifères, auxquels est ajouté du LY294004 (un inhibiteur chimique de la PI3K) [ 8]. Le milieu utilisé est un milieu défini (AFBLy) [ 9] dépourvu de sérum mais contenant différents suppléments dont l’insuline et l’alcool polyvinylique, substitut de l’albumine sérique. Dans ces conditions, non seulement les marqueurs de pluripotence étaient réprimés mais 80 % des cellules exprimaient fortement les marqueurs de l’endoderme (Sox17, GSC [goosecoid], Mixl1 [Mix1 homeobox-like 1], Lhx1 [LIM homeobox protein 1], CXCR4 [récepteur de chimiokine], GATA6). De plus l’absence de Sox7, marqueur du tissu extra-embryonnaire, et de Sox2, marqueur du neurectoderme, exclut que nos conditions aient induit des cellules de l’endoderme primitif ou des progéniteurs neuronaux.
• Spécification hépatique. Les cellules de l’endoderme définitif ont été cultivées 3 jours en présence de FGF10, puis 2 jours en présence de FGF10 et d’acide rétinoïque, ces deux facteurs étant connus pour leur rôle critique dans la croissance du foie et la survie des hépatocytes in vivo [ 10, 11]. L’ajout de SB431542, un inhibiteur pharmacologique des récepteurs à l’activine/Nodal, a permis d’augmenter l’expression des marqueurs de spécification. Les cellules de l’endoderme définitif exprimaient un niveau élevé de Wnta, confirmant des résultats déjà publiés sur le rôle essentiel de Wnta dans les mécanismes contrôlant la spécification des cellules d’endoderme définitif en endoderme hépatique.
• Obtention d’hépatoblastes. L’ajout de plusieurs facteurs (FGF4, HGF et EGF) pendant 5 jours a induit la prolifération d’une population de cellules exprimant des marqueurs de progéniteurs hépatiques : environ 50 % des cellules co-exprimaient l’AFT et la cytokératine 19 (CK19), marqueur des hépatocytes et des cellules biliaires respectivement, suggérant que cette population correspond aux hépatoblastes, progéniteurs communs à ces deux types cellulaires dans le foie fœtal. Les cellules exprimaient également EpCam (epithelial cell adhesion molecule), un marqueur de cellules souches/progénitrices du foie fœtal [ 12, 43] et des facteurs de transcription hépatique tel HNF4a - connu pour contrôler l’expression de nombreux gènes spécifiques [ 13] (Figure 2). Ces cellules ont été transplantées dans des souris immunodéficientes¹ uPAxRagγc ^−/− transgéniques pour l’urokinase (aussi appelée activateur du plasminogène ou PA). Chez ces animaux, l’expression de l’urokinase est toxique pour les hépatocytes endogènes, ce qui bloque transitoirement la régénération et permet une meilleure prise de greffe des cellules transplantées. Huit semaines après transplantation, des ilôts de cellules co-exprimant l’albumine ou l’alpha-1-antitrypsine humaine et la GFP (green fluorescent protein) ont été mis en évidence sans apparition concomitante de tératomes. Ainsi, les cellules hépatiques dérivées des CSEh sont non seulement capables de greffer chez l’hôte receveur et de rester fonctionnelles, mais aussi de proliférer in situ dans ce foie receveur.
• La différenciation des progéniteurs en hépatocytes. Elle a été induite in vitro par l’ajout d’hydrocortisone, d’une combinaison de facteurs de croissance (FGF4, EGF et HGF), connus pour être impliqués dans la croissance du foie fœtal, et d’oncostatine. Après huit jours de culture dans ces conditions, les cellules hépatiques exprimaient plusieurs protéines caractéristiques des fonctions hépatocytaires comme l’α1-anti-trypsine, le récepteur des low density lipoproteins, l’apolipoprotéine A-II (ApoAII), la tyrosine aminotransférase, la tryptophane 2,3-dioxygénase, le récepteur aux asialoglycoprotéines de type 1, le facteur IX de coagulation et les cytochromes P450, CYP3A7 et Cyp7A1 spécifiques du foie fœtal. Tous ces marqueurs étaient exprimés de façon similaire à leur expression dans des cellules hépatiques fœtales primaires (Figure 2).

En termes de fonctionnalité in vitro, les hépatocytes dérivés des CSEh étaient capables de sécréter de l’urée et de l’albumine, d’internaliser puis d’excréter le vert d’indocyanine (fonctions spécifiques des hépatocytes) et montraient une activité CYP3A7. L’ensemble de ces résultats, incluant l’absence du CYP3A4, suggère que les cellules ainsi différenciées correspondent à des hépatocytes fœtaux. L’absence dans nos expériences de formation de tératomes ou d’adénocarcinomes alors que nous n’avons pas inclus d’étape finale de purification suggère que nos conditions induisent bien l’engagement dans la voie de différenciation hépatocytaire de la totalité des cellules pluripotentes.

La maturation d’hépatocytes fœtaux en hépatocytes adultes nécessitera probablement la mise en place de cocultures, les hépatocytes fonctionnant in vivo en étroites interactions avec les autres cellules du foie. Si la génération d’hépatocytes complètement différenciés (qui expriment les enzymes de détoxification de phases I et II) est nécessaire pour les études de pharmacotoxicologie ou pour la mise au point de foies bioartificiels, ce n’est en revanche pas le cas pour les approches de thérapie cellulaire des maladies métaboliques hépatiques. En effet, de nombreuses études chez les rongeurs et le primate ont montré une faible efficacité (< 50 %) de la prise de greffe d’hépatocytes adultes et l’absence de prolifération de ces cellules in situ. L’utilisation de progéniteurs de type hépatoblastes pourrait être une alternative plus efficace. La preuve de concept a été établie avec les précurseurs neuronaux [ 14] et nous avons montré que des progéniteurs fœtaux pouvaient proliférer et se différencier dans le foie de souris [ 15]. De nombreux modèles murins sont encore nécessaires pour mieux caractériser le devenir des cellules dérivées des CSEh in vivo après transplantation. Mais en aucun cas ils ne pourront être suffisants, et des approches précliniques sur le primate devront être développées avant d’envisager toute application thérapeutique. Après le report initial des essais prévus par Geron, le premier patient atteint d’une lésion de la moelle épinière vient d’être traité aux États-Unis en octobre 2010 par des progéniteurs d’oligodendrocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines. D’autres essais cliniques de phases I/II sont prévus aux États-Unis et en Angleterre en 2011 pour le traitement de patients atteints de dégénérescence maculaire avec les cellules hES différenciées [ 16]. Notons qu’en France, l’équipe de Michel Pucéat et Philippe Ménasché progresse dans l’évaluation d’un protocole thérapeutique utilisant des progéniteurs cardiaques dérivés de CSEh récemment évalués dans le modèle préclinique du macaque [ 44]. Le long cheminement nécessaire pour aboutir à des applications cliniques de ces cellules est donc désormais amorcé aussi en France.

Mais cet énorme potentiel des cellules iPS doit faire face à de nombreux obstacles, résumés ci-dessous, et qui soulèvent à l’heure actuelle la question de leur utilisation en médecine régénérative dans un futur proche [ 20].

• Les vecteurs de transduction. Les plus utilisés sont les rétrovirus et les lentivirus, qui contiennent les séquences codant les différents facteurs responsables de la reprogrammation, inductibles ou non, excisables ou non. Ces vecteurs intégratifs impliquent un risque de mutagenèse insertionnelle et d’activation ou de répression de gènes endogènes [ 21]. C’est cette approche qui induit la meilleure efficacité de reprogrammation, mais celle-ci reste cependant très faible : de 0,1 % à 0,01 % selon les cellules. Cette efficacité chute de 100 à 1 000 fois lorsque des plasmides, des adénovirus non intégratifs ou des protéines fusion sont utilisés [ 22].
• Les gènes. Tous les gènes de pluripotence utilisés pour produire des iPS sont soit des oncogènes bien établis, Myc et Klf4, soit des protéines liées à la tumorigenèse comme Sox2, Nanog et Oct3/4. Ainsi, il a été récemment montré que c-Myc et Lin28 répriment la transcription de certains microARN, spécialement les membres de la famille LET-7. Cette famille de miARN est souvent réprimée dans les cancers humains, ce qui conduit à la dérépression de leurs cibles comme HMGA-2 (high mobility group), K-Ras and c-Myc et promeut l’oncogenèse [ 23]. Certains de ces facteurs, en particulier c-Myc et Klf4, ne sont pas indispensables, mais l’efficacité de reprogrammation est dramatiquement réduite en leur absence. La question reste posée du risque de réduction de la « souchitude » des cellules ainsi isolées et/ou, lors de la reprogrammation, de la sélection de cellules exprimant des niveaux élevés de protéines Myc endogènes et potentiellement plus prédisposées à la tumorigenèse [22].
• La reprogrammation. Bien que l’extinction des gènes codant les différents facteurs survienne après la reprogrammation, celle-ci est parfois incomplète et une expression résiduelle des facteurs a été mise en évidence. La réactivation peut survenir à des stades plus tardifs comme l’ont montré des études sur les chimères in vivo [ 24]. Une reprogrammation incomplète ou aberrante peut résulter en la formation de tumeurs malignes après transplantation. La reprogrammation correcte d’une cellule somatique implique que cette dernière subisse des changements épigénétiques (déméthylation de l’ADN, modifications des histones). Une étude récente analysant la méthylation à l’échelon du génome a montré des différences significatives entre le méthylome des cellules iPS et celui des cellules ES [ 25]. Le moyen de vérifier la pluripotence est la formation de tératomes in vivo. Mais celle-ci ne garantit pas à elle seule la reprogrammation complète des cellules car beaucoup des lignées murines iPS similaires aux cellules ES forment des tératomes mais ne produisent pas de chimères de la lignée germinale. Il est de ce fait difficile de prouver actuellement la reprogrammation complète des cellules humaines [ 26, 27], et des modèles in vivo de transplantation via différentes voies seront nécessaires pour s’assurer de la réelle pluripotence des cellules. Nul doute que le développement des techniques de criblage à haut débit conduira, dans un futur plus ou moins proche, à l’identification de petites molécules chimiques capables d’induire la reprogrammation [ 28]. L’alternative plus immédiate sera l’utilisation de systèmes de transfert de gènes non intégratifs et efficaces. Il restera à développer des méthodes permettant d’augmenter l’efficacité de la reprogrammation, à définir des approches pertinentes et les plus stringentes possibles de criblage in vitro et in vivo pour caractériser la pluripotence, l’absence des modifications chromosomiques mineures, et certaines modifications épigénétiques.

Nous avons montré que les conditions de différenciation des CSEh en hépatocytes que nous avons décrites permettent d’induire la différenciation d’iPS dérivées de fibroblastes humains en cellules de l’endoderme [ 29] puis en progéniteurs hépatiques [7]. Ainsi des études de fonctionnalité in vivo pourront être réalisées de façon comparative avec ces deux types de progéniteurs. Nous avons également montré que des iPS générées à partir de patients atteints de maladies métaboliques hépatiques reproduisaient, après différenciation en hépatocytes, le phénotype de la maladie [ 30].

De nombreux travaux montrent désormais que la transdifférenciation des cellules souches hématopoïétiques en hépatocytes est inefficace à moins que, dans certains modèles de rongeurs, les animaux ne subissent une irradiation (sub)létale préalable, inenvisageable chez l’homme. Dans un certain nombre de cas, ce phénomène correspond à une fusion de cellules hématopoïétiques avec les hépatocytes endogènes [ 31, 32].

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont d’un intérêt potentiel certain, mais les données actuelles suggèrent qu’elles jouent un rôle essentiellement de support trophique dans les foies lésés en inhibant la mort des hépatocytes et en stimulant leur prolifération [ 33- 36]. Notons toutefois que le traitement des CSM dérivées du tissu adipeux et cultivées dans des conditions adaptées aux hépatocytes, par la 5-azacytidine, un inhibiteur puissant des méthyltransférases connu pour induire de façon non spécifique la réactivation de gènes silencieux, induit une différenciation en cellules « de type hépatocyte ». Ces cellules prolifèrent après leur transplantation dans un modèle de souris traitées à la monocrotaline (un alcaloïde à structure pyrrolizidine qui bloque la prolifération des hépatocytes endogènes) et hépatectomisées [ 37]. Toutefois les CSM, comme toutes les cellules somatiques, ont une capacité d’autorenouvellement limitée, n’ayant pas d’activité télomérase ; en culture, elles entrent en phase de sénescence réplicative après un certain nombre de doublements de population [ 38, 39].

Les cellules ovales du foie adulte : ce sont des cellules appelées facultative stem cells par nos collègues anglo-saxons car après hépatectomie partielle, seuls les hépatocytes prolifèrent et régénèrent le foie. Chez les rongeurs, la prolifération des cellules ovales est induite dans les situations où les hépatocytes sont détruits par des agents toxiques ou des carcinogènes [ 40]. Elles sont bipotentes et expriment des marqueurs d’hépatocytes et de cholangiocytes fœtaux comme le font les hépatoblastes. Chez l’homme, après de nombreuses années de controverse, des cellules souches et progénitrices hépatiques ont été isolées non seulement du foie fœtal mais aussi du foie pédiatrique sur la base d’un tri de cellules EpCam⁺ [12, 41]. Toutefois le phénotype des cellules isolées n’est pas encore complètement défini. De plus, l’activité télomérase mise en évidence dans les foies fœtaux est inexistante dans les cellules souches dérivées des foies nouveau-nés [ 42].