Dans le domaine de la santé, un des grands défis actuels concerne la restitution efficace dans le corps humain de médicaments grâce à de nouveaux nanovecteurs non toxiques susceptibles d’un adressage ciblé dans l’organisme. Une thérapie efficace demande que ces vecteurs soient capables :

• de stocker des quantités importantes du médicament considéré ;
• d’éviter une restitution trop rapide (quelques minutes) dans l’organisme (ce que les Anglo-Saxons appellent le burst effect) ;
• de contrôler leur dégradation et de ne pas présenter d’effet toxique ;
• dêtre volontairement modifiables en surface pour contrôler les réactions in vivo ;
• dêtre détectables par les techniques d’imagerie médicale.

Dans l’idéal, une fois toutes ces conditions remplies, ces nanovecteurs devraient permettre d’accéder à une nouvelle étape de la médecine moléculaire (la théragnostique) qui combine thérapie et diagnostic pour aboutir à un traitement réellement personnalisé des patients. Pour un adressage efficace par voie intraveineuse durant tout son parcours jusqu’à la cible, il faut que le médicament (souvent instable, ou présentant une faible solubilité dans les milieux biologiques) puisse être protégé à l’intérieur de vésicules nanométriques (les vecteurs) qui assurent son intégrité et son transport jusqu’à l’organe, le tissu ou la cellule malades. Les vecteurs actuellement utilisés [ 1– 5] ne satisfont que très partiellement à ce cahier des charges. Ce sont le plus souvent (Figure 1) :

• des liposomes, petites particules sphériques constituées d’une double couche de lipides (glycérophospholipides) servant d’enveloppe à différentes substances médicamenteuses. En fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques, celles-ci peuvent être solubilisées soit dans la phase aqueuse interne des liposomes, soit dans les bicouches lipidiques. Ces sphères peuvent traverser les membranes des cellules et transporter les principes actifs jusqu’au cœur de celles-ci ;
• des micelles et des nanoémulsions, autres types de vésicules ;
• des nanoparticules, dans lesquelles le principe actif se trouve solubilisé, encapsulé ou adsorbé au sein de la matrice : organiques (typiquement polymériques : microcapsules, microsphères), inorganiques ou hybrides.

Figure 1 Aspect d’un liposome, d’une micelle et, par comparaison, d’un solide hybride poreux. S’agissant des liposomes et des micelles, les figures ne représentent qu’une seule vésicule, mais les agrégats réels ont des dimensions d’environ 100 nm pour les liposomes et de 30 à 50 nm pour les micelles.

Figure 1 Aspect d’un liposome, d’une micelle et, par comparaison, d’un solide hybride poreux. S’agissant des liposomes et des micelles, les figures ne représentent qu’une seule vésicule, mais les agrégats réels ont des dimensions d’environ 100 nm pour les liposomes et de 30 à 50 nm pour les micelles.

En particulier, les quantités de médicament transportées restent faibles (de l’ordre de 5 grammes de médicament pour 100 grammes de vecteur), limitées en cela par la faible taille des vésicules (quelques angströms (1Å = 10⁻¹⁰ m), assorties parfois du burst effect. Nous venons de faire significativement progresser le domaine par deux avancées : la pégylation/squalénisation et l’utilisation de solides poreux hybrides comme vecteurs [ 31].

La pégylation a permis la conception de vecteurs dits « de deuxième génération » (nanoparticules, liposomes) capables d’atteindre les territoires pathologiques en évitant leur capture par le système réticuloendothélial (SRE). Le polyéthylène glycol (PEG) constitue un bouclier qui empêche l’adsorption des protéines sériques responsables de la reconnaissance par le SRE. Ce polymère très hydrophile améliore par ailleurs la compatibilité des biomatériaux. Les nanoparticules qui en sont recouvertes ont un temps de passage dans le torrent circulatoire très augmenté (quelques heures au lieu de quelques minutes) [ 6].

Dans le domaine du cancer, ces nouveaux vecteurs, qualifiés de « furtifs », ciblent le tissu tumoral avec une certaine spécificité par la combinaison de l’augmentation du temps de circulation des nanoparticules dans le sang et de la perméabilité vasculaire des vaisseaux sanguins irriguant la tumeur (effet EPR¹).

Le concept de squalénisation tire profit de la conformation moléculaire compacte du squalène pour obtenir des systèmes nanoparticulaires en couplant cette molécule à des analogues nucléosidiques à activité anticancéreuse ou antivirale [ 7]. Les nanomédicaments squalénés obtenus sont beaucoup plus efficaces que les molécules d’origine dans des modèles de cancers expérimentaux (leucémies et tumeurs solides) car ils : (1) peuvent être administrés par voie intraveineuse ou orale ; (2) favorisent la pénétration intracellulaire des analogues nucléosidiques ; (3) ont un passage transmembranaire facilité ; et (4) sont protégés de la dégradation et du métabolisme.

Ces solides ont une existence récente [ 8]. Ils sont obtenus par synthèse hydro-solvothermale (150 °C-30 bars). Tridimensionnels, ils résultent de l’assemblage exclusivement par liaisons fortes d’agrégats inorganiques et de ligands organiques (essentiellement des carboxylates et des phosphonates) aisément modulables. Le nombre quasi infini de combinaisons entre parties organiques et inorganiques justifie l’actuel développement extensif de ces matériaux. Suivant la topologie de la structure qui en résulte, ces matériaux forment des pores soit rigides, soit hautement flexibles (variation de volume supérieure à 300 %) [ 9] sous l’action du médicament. Ces grands pores (jusqu’à 4,7 nm de diamètre), disposés régulièrement dans la structure, sont facilement modulables en fonction des applications choisies (Figure 1). De plus, suivant les cas, la paroi interne des pores peut être rendue hydrophile ou hydrophobe. Les structures flexibles autorisent une adaptation de la porosité à la forme de la molécule insérée. Maintenant connus sous le label MIL-n (MIL pour matériaux de l’Institut Lavoisier), nos produits correspondent aux deux cas. Certains font déjà l’objet d’une production industrielle (MIL-53 commercialisé par BASF sous le nom de Basolite-100). Dans l’étude présentée ici, sont utilisées deux structures flexibles (les téréphtalates MIL-53 et MIL-88) à base de tunnels de dimensions utiles 0,8-1,1 nm et deux structures rigides (carboxylates MIL-100 et -101 à très larges pores, de diamètre 2,5-3,4 nm), toutes à base de fer(III), cation choisi à la fois pour sa non-toxicité et son activité en imagerie médicale (Figure 2). Ces phases autorisent déjà à 25°C le piégeage en grande quantité de gaz polluants, en particulier le CO2 et le méthane [ 10].

Figure 2 Structures, à la même échelle, des pores des nanovecteurs hybrides étudiés. Les parties inorganiques à base de fer(lIl) sont représentées sous forme d’octaèdres métalliques et les ligands par des assemblages de sphères. De gauche à droite : le MIL-53, un téréphtalate de fer dans lequel les octaèdres de fer forment des chaînes ; le MIL-88, autre téréphtalate de fer, lui aussi flexible, dans lequel la partie inorganique est constituée de trimères d’octaèdres, ce qui sera également le cas pour les deux phases suivantes ; le MIL-100, trimésate de fer ; le MIL 101, téréphtalate de fer formant des mésopores.

Figure 2 Structures, à la même échelle, des pores des nanovecteurs hybrides étudiés. Les parties inorganiques à base de fer(lIl) sont représentées sous forme d’octaèdres métalliques et les ligands par des assemblages de sphères. De gauche à droite : le MIL-53, un téréphtalate de fer dans lequel les octaèdres de fer forment des chaînes ; le MIL-88, autre téréphtalate de fer, lui aussi flexible, dans lequel la partie inorganique est constituée de trimères d’octaèdres, ce qui sera également le cas pour les deux phases suivantes ; le MIL-100, trimésate de fer ; le MIL 101, téréphtalate de fer formant des mésopores.

Avant d’étudier leurs possibilités pour le stockage et la restitution d’antitumoraux et d’antirétroviraux, nous avons validé notre méthode sur l’ibuprofène [ 11– 14]. Qu’ils soient flexibles ou rigides, les MIL donnent des résultats spectaculaires, tant en termes de quantité stockée que de temps de libération (jusqu’à trois semaines pour le MIL-53). En particulier, le MIL-101 est capable de stocker 1,4 gramme d’ibuprofène par gramme de produit et de le libérer complètement en six jours.

Nanofabrication et non-toxicité

Deux étapes essentielles au respect du cahier des charges devaient être franchies en préalable à l’insertion des médicaments : (1) montrer que les solides choisis pouvaient être obtenus sous forme nanométrique afin d’autoriser ultérieurement des injections intraveineuses, et (2) s’assurer de leur biodégradabilité et de leur nontoxicité intrinsèques.

En jouant sur tous les paramètres de la synthèse (nature du précurseur ferrique et du solvant - eau ou éthanol -, acidité de la solution, température), il a été à chaque fois possible (Figure 3) d’obtenir ces nanoparticules de dimensions compatibles (< 200 nm) avec une injection sans dommages (Tableau I).

Tableau I Taille des nanoparticules, taille et performances des médicaments testés. Les dimensions en Å pour les molécules de médicaments sont celles estimées par simulation dans une atmosphère sous vide. La charge reflète la quantité de médicament encapsulée dans le solide, exprimée en % du poids du médicament par rapport au poids du solide. L’efficacité est exprimée en % de médicament encapsulé par le MIL par rapport à la quantité totale utilisée pour l’imprégnation (ou encapsulation). nd : non déterminé, l’encapsulation du médicament dans le MIL n’ayant pas été étudiée. *Taille des particules (nm).

Tableau I Taille des nanoparticules, taille et performances des médicaments testés. Les dimensions en Å pour les molécules de médicaments sont celles estimées par simulation dans une atmosphère sous vide. La charge reflète la quantité de médicament encapsulée dans le solide, exprimée en % du poids du médicament par rapport au poids du solide. L’efficacité est exprimée en % de médicament encapsulé par le MIL par rapport à la quantité totale utilisée pour l’imprégnation (ou encapsulation). nd : non déterminé, l’encapsulation du médicament dans le MIL n’ayant pas été étudiée. *Taille des particules (nm).

Figure 3 Micrographies de microscope électronique à balayage des nanoparticules de MIL-88 et de MIL-100.

Figure 3 Micrographies de microscope électronique à balayage des nanoparticules de MIL-88 et de MIL-100.

La présence de groupements réactifs en surface (sites métalliques, contre-ions ou groupements carboxyliques) permet de modifier celle-ci afin de contrôler le devenir in vivo des nanoparticules. Ainsi, le PEG leur confère une furtivité, mais des polysaccharides comme le dextrane et le chitosan ont aussi pu être associés, ouvrant d’autres perspectives comme le ciblage spécifique et la bioadhésion.

Le début de dégradation in vitro en conditions physiologiques n’intervient qu’après une semaine d’incubation à 37°C, et cette dégradation est assortie d’une perte de cristallinité des particules et d’une libération significative des ligands constitutifs, notoirement non toxiques [ 15– 18]. En termes de cytotoxicité, leur étude in vitro sur des macrophages de souris par la méthode MTT² [ 19] démontre que la concentration pour laquelle les MIL sont non toxiques est comparable à celle des nanoparticules déjà existantes (< 60 mg/ml) [ 20]. La toxicité in vivo a été testée après administration intraveineuse des nanoMIL à des rats Wistar femelles. Les doses injectées étaient très importantes (220 mg/kg). Par comparaison avec des groupes de rats contrôles, le comportement des animaux, le poids de leurs corps et organes ainsi que des paramètres sériques et hépatiques ne montrent aucune anomalie à l’issue des trois mois d’observation, ce qui prouve à la fois le caractère réversible de l’opération et la non-toxicité des nanoMIL. De plus, l’absence d’activation du cytochrome P-450 suggère l’excrétion directe des acides organiques. Enfin, une injection répétée pendant quatre jours de 150 mg/kg/jour n’entraîne aucune manifestation d’effets toxiques au moins dans les dix jours suivants.

Médicaments et performances d’encapsulation

La non-toxicité avérée des nanoparticules de MIL autorise leur utilisation comme véhicules de médicaments anticancéreux et antirétroviraux dont l’efficacité est souvent limitée par leur forte insolubilité et/ou leur libération trop rapide. Nous avons choisi quatre médicaments (Figure 4) aux caractéristiques différentes pour évaluer l’éventuelle généralité de notre méthode. Ces médicaments sont : l’agent antitumoral busulfan, les nucléotides cidofovir (CDV), forme monophosphorylée d’un phosphonate antiviral actif contre les cytomégalovirus, et l’azidothymine triphosphorylée (AZT-TP) utilisée contre le VIH (virus de l’immunodéficience humaine), tous deux hydrophiles, et, enfin, l’hydrophobe doxorubicine (doxo), un des agents les plus efficaces dans le cancer du sein.

Figure 4 Structure des quatre médicaments encapsulés dans le carboxylate de fer. Les atomes sont indiqués par leur couleur : carbone (noir), oxygène (rouge), azote (bleu), soufre (jaune), phosphore (rose), hydrogène (blanc).

Figure 4 Structure des quatre médicaments encapsulés dans le carboxylate de fer. Les atomes sont indiqués par leur couleur : carbone (noir), oxygène (rouge), azote (bleu), soufre (jaune), phosphore (rose), hydrogène (blanc).

Le busulfan, amphiphile antitumoral, est largement utilisé en combinaison avec des traitements de chimiothérapie lourde, en particulier dans les leucémies de l’enfant [ 21, 22]. Pris tel quel, il présente une faible stabilité en solution aqueuse et une importante toxicité hépatique due à sa microcristallisation dans le système microveineux du foie [ 23]. De plus, l’encapsulation actuelle de busulfan par les nanovecteurs disponibles, comme les liposomes ou les polymères, n’excède guère les 6 % en poids [ 24], justifiant ainsi le test de nos nanoMIL comme une alternative intéressante à ce qui existe. En effet, l’imprégnation des MIL donne parfois des résultats exceptionnels. Par exemple, le MIL-100 stocke 25 % en poids de busulfan, soit cinq fois plus que le meilleur polymère nanométrique et soixante fois plus que les liposomes (0,4 % en poids) [23, 25]. Les MIL flexibles (MIL-53 et -88) ont des performances moindres, mais néanmoins supérieures à ce qui existe. Cela signifie que l’utilisation des nanoMIL représente un grand progrès dans la thérapie par le busulfan, en particulier parce qu’il faut moins de nanovecteurs pour administrer la dose requise de médicament, sans les risques de recristallisation dans le système veineux hépatique. Des expériences in vitro montrent que le busulfan est libéré sous sa forme active, et son efficacité est constante, qu’il soit sous forme libre ou encapsulée. Les nucléotides, peu stables en milieu biologique, ont de courtes durées de vie et entraînent parfois une résistance notable au médicament [ 26, 28]. Le fort caractère hydrophile du CDV et de l’AZT-TP limite également leur pénétration intracellulaire, à cause de leur faible perméabilité membranaire [ 27, 28]. Bien que quelques nanovecteurs aient été mis au point pour pallier ces inconvénients, leur efficacité est très faible et s’accompagne de burst effects [ 29].

Tel n’est pas le cas pour les carboxylates de fer (Tableau I). Après imprégnation, ils présentent là encore des efficacités d’adsorption remarquables, parfois supérieures à 90 %. Par exemple, le MIL-100 stocke respectivement 25, 21, 16 et 9 % en poids de busulfan, AZT-TP, CDV et doxo. Le record appartient aux nanoparticules de MIL-101 qui encapsulent 42 % d’AZT-TP et de CDV, valeur sans précédent comparée à celles reportées dans la littérature pour ces composés (1 %).

Libération contrôlée

Les libérations de l’AZT-TP, du CDV et de la doxo sont progressives, sans burst effect (Figure 5). La comparaison entre les cinétiques de libération et de dégradation des médicaments suggère que le processus de libération est gouverné, non pas par la dégradation des MIL, mais par leur diffusion à partir des pores. La libération totale de l’AZT-TP par le MIL-100 intervient ainsi en trois jours, alors que seuls 10° % du vecteur se sont dégradés.

Figure 5 Libération temporelle par les nanoparticules de MIL-100. Du CDV (noir), de l’AZT-TP (bleu) et de la doxo (rouge) sous conditions physiologiques simulées (tampon PBS, 37°C).

Figure 5 Libération temporelle par les nanoparticules de MIL-100. Du CDV (noir), de l’AZT-TP (bleu) et de la doxo (rouge) sous conditions physiologiques simulées (tampon PBS, 37°C).

Ce résultat prometteur a incité à évaluer in vitro l’activité anti-VIH de l’AZT-TP, encapsulé dans le nanovecteur MIL 100 sur des cellules mononucléées de sang humain infectées par la souche VIH-1 LAI. Pour une concentration de 200 nM d’AZT-TP encapsulée dans les nanoparticules du MIL-100, l’activité anti-VIH se traduit par 90 % d’inhibition de la réplication du VIH comparativement à une inhibition nulle avec l’AZT libre.

Utilité en imagerie

Comme décrit précédemment, les structures MIL sont toutes à base de fer(III). Ce cation a été choisi en fonction de ses capacités à servir d’agent de contraste en imagerie médicale, de la même façon que le gadolinium [ 30] et le manganèse [8]. Après vérification que c’étaient bien les carboxylates (et non des hydroxydes issus de la dégradation) qui étaient responsables de l’effet, les mesures d’imagerie de résonance magnétique ont été faites sur des rats Wistar femelles après injection de suspensions de MIL-88 à 220 aux doses de 44 et 22 mg/kg. Les séquences d’écho de gradient et d’écho de spin³ ont démontré que les images obtenues pour les organes traités sont plus sombres que celles issues d’organes d’animaux contrôles non traités (Figure 6), en particulier pour la rate et le foie. Trois mois après l’injection, l’identité des images d’organes d’animaux traités et contrôles a prouvé, a posteriori, que le séjour des nanoMIL dans ces organes était temporaire. L’efficacité des composés à base de fer tient à leur capacité à modifier, sous l’action d’un champ magnétique, les temps de relaxation des protons de l’eau dans le milieu.

Figure 6 Images de résonance magnétique. Les images ont été acquises par des séquences d’écho de gradient (a, c, d, f) ou d’écho de spin (b, e) sur des rats soit non traités (a, b, c) ou traités (d, e, f) par une injection de 220 mg/kg de MIL-88 visant le foie (a, b, d, e) et la rate (c, f). L’effet du produit est observable (organes plus sombres) 30 mn après l’injection (dm : muscle dorsal ; k : rein ; li : foie ; s : rate ; st : estomac).

Figure 6 Images de résonance magnétique. Les images ont été acquises par des séquences d’écho de gradient (a, c, d, f) ou d’écho de spin (b, e) sur des rats soit non traités (a, b, c) ou traités (d, e, f) par une injection de 220 mg/kg de MIL-88 visant le foie (a, b, d, e) et la rate (c, f). L’effet du produit est observable (organes plus sombres) 30 mn après l’injection (dm : muscle dorsal ; k : rein ; li : foie ; s : rate ; st : estomac).

Les faits prouvent que les carboxylates poreux de fer(III) représentent désormais les meilleurs nanovecteurs pour l’encapsulation et la libération de médicaments importants. Obtenus en solution soit aqueuse, soit alcoolique, au lieu d’utiliser des solvants organiques, ils fournissent le premier exemple de l’apport d’une technologie « verte » aux applications médicales. Ces nanovecteurs, non toxiques et biodégradables, agissent comme des éponges moléculaires capables de stocker, par simple imprégnation, des quantités très importantes de médicaments antitumoraux et antiviraux de polarités, de tailles et de fonctionnalités différentes, actives contre le cancer et le sida, avant leur libération contrôlée sans dommage sur plusieurs jours.

On peut considérer que ces nanovecteurs, qui respectent intégralement le cahier des charges, représentent le premier exemple de nanotransporteurs universels de médicaments et rendent possible un des rêves actuels de la médecine : disposer de nouveaux vecteurs qui conjuguent simultanément les possibilités de thérapie et de diagnostic. Cette nouvelle branche de la médecine, la théragnostique, qui vise à un traitement personnalisé des patients, est appelée à un grand avenir dans les années qui viennent. Les MIL ouvrent une grande opportunité en ce sens.

La voie est ouverte vers l’utilisation thérapeutique des nanovecteurs, mais est-elle perfectible ? Sans aucun doute, et, maintenant que notre stratégie de caractérisation est bien établie, nos recherches actuelles visent la découverte de nouveaux matériaux, toujours aussi dépourvus de toxicité, à partir d’autres ions métalliques bénins pour l’organisme. Deux directions sont actuellement privilégiées : la première, au vu des performances exceptionnelles des MIL-100 et MIL-101, s’oriente vers la création rationnelle de matrices hybrides poreuses avec des cavités de plus en plus spacieuses pour accroître les capacités de stockage, et donc diminuer la quantité de solide hybride injectée dans l’organisme sans affecter l’efficacité optimale du médicament. La seconde orientation, qui n’en est qu’à ses balbutiements, serait, au lieu d’encapsuler le médicament dans les pores, de se servir de lui comme ligand constitutif du squelette de l’hybride. Ainsi transporté, ce serait alors la dégradation du nanovecteur médicamenteux qui libérerait le principe actif, avec une cinétique qui serait fonction de la capacité du vecteur à s’autodétruire dans l’organisme. Des essais vont actuellement dans ce sens. Ils concernent également la modification superficielle de ce nanoMIL pour apporter aux vecteurs des propriétés de furtivité, de ciblage et de bioadhésion.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts concernant les données publiées dans cet article ni concernant les brevets.