La délétion du gène codant pour RANKL chez la souris a fourni l’une des premières preuves du rôle crucial de ce facteur, à la fois dans le système osseux et dans le système immunitaire. Les souris déficientes en RANKL présentent une ostéopétrose, liée à l’absence d’ostéoclastes, dont la sévérité est caractérisée par l’absence d’éruption des dents et de cavité médullaire [ 17]. Par conséquent, le siège de l’hématopoïèse est déplacé de la moelle osseuse vers la rate ou le foie [ 18]. Si le nombre de monocytes et de macrophages n’est pas affecté chez les souris RANKL^−/−, ces animaux sont dépourvus de ganglions lymphatiques et présentent un thymus de taille réduite, ainsi qu’une splénomégalie. Ces travaux ont démontré la nécessité de RANKL dans le développement des précurseurs lymphocytaires. Quant aux souris déficientes pour le récepteur RANK, elles expriment pour l’essentiel le même phénotype que celui des souris RANKL^−/− (ostéopétrose, absence totale de ganglions lymphatiques, maturation des lymphocytes B altérée), bien que la différenciation thymique soit intacte [ 19]. Enfin, il existe un récepteur leurre soluble de RANKL, l’ostéoprotégérine (OPG), synthétisé par les ostéoblastes, les cellules lymphoïdes et les DC, qui inhibe l’interaction RANK/RANKL [ 20] et se comporte donc comme un régulateur négatif important de l’ostéoclastogenèse. Les souris OPG^−/− présentent effectivement une ostéoporose sévère caractérisée par une importante porosité de l’os cortical et une forte incidence de fractures. De plus, le développement des lymphocytes B est altéré et les DC ont une capacité accrue à stimuler la prolifération des lymphocytes T [ 21].

Le rôle de RANKL dans la PR a été mis en évidence après avoir constaté que des souris RANKL^−/− étaient protégées de la dégradation osseuse induite par le transfert de sérum dans un modèle d’arthrite inflammatoire destructrice [5]. Bien que les lymphocytes soient la source majeure de RANKL, des travaux ont montré que le RANKL exprimé à la surface des fibroblastes synoviaux est également responsable de la destruction osseuse [ 22]. De plus, on observe chez l’homme une surexpression de RANKL, accompagnée d’une diminution d’OPG dans les tissus synoviaux de patients atteints d’une forme active et destructive de PR [ 23]. Même si les mécanismes responsables du déséquilibre de la balance RANKL/OPG doivent être éclaircis, l’implication de la triade RANKL/RANK/OPG dans la dégradation osseuse de la PR est bien caractérisée. Des études récentes concernant l’utilisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre RANKL - mimant ainsi la fonction d’OPG - dans le traitement de la perte osseuse liée à la PR donnent des résultats encourageants [ 24].

Figure 3. Intégration des voies RANK et ITAM par les protéines kinase Btk et Tec. L’ostéoclastogenèse est stimulée par les ostéoblastes, les lymphocytes T, les fibroblastes synoviaux et les cellules stromales de la moelle osseuse qui fournissent le RANKL, le M-CSF et les ligands - encore inconnus - des adaptateurs à domaines ITAM. La liaison de RANKL à son récepteur RANK permet à la fois le recrutement de TRAF6, qui active NK-κB et les MAPK, JNK et ERK, et celui de c-Fos qui induit la formation du complexe AP-1. Les facteurs de transcription NK-κB et AP-1 vont alors permettre en partie l’activation de NFATc1, facteur de transcription clé de la différenciation ostéoclastique. Les kinases Btk et Tec sont également activées par RANK après phosphorylation. En parallèle, les adaptateurs DAP12 et FcRγ possèdent dans leur domaine intracellulaire un motif ITAM chargé de deux tyrosines. Après interaction des récepteurs membranaires (TREM-2, OSCAR, MDL-1, SIRPβ - signal-regulatory protein β - et PIRα) avec leurs ligands respectifs et leur association avec leur adaptateur, ces derniers sont phosphorylés par les kinases de la famille Src. Cela entraîne la création de sites d’ancrage permettant le recrutement des tyrosine kinases Syk qui sont alors phosphorylées. L’ensemble induit l’activation de protéines adaptatrices comme BLNK (B cell linker) et SLP-76 qui permettent la formation du complexe de signalisation ostéoclastogénique en recrutant à la fois les kinases Tec et Btk induites par RANK et la PLCγ (phospholipase Cγ). Ce complexe est indispensable à l’augmentation du flux calcique, lui-même nécessaire à l’activation de NFATc1. De nombreuses études concernant NFATc1 ont permis de montrer qu’il régulait directement de nombreux gènes spécifiques des ostéoclastes tels que TRAP, le récepteur à la calcitonine, la cathepsine K, l’intégrine αVβ3 et OSCAR.

Figure 3. Intégration des voies RANK et ITAM par les protéines kinase Btk et Tec. L’ostéoclastogenèse est stimulée par les ostéoblastes, les lymphocytes T, les fibroblastes synoviaux et les cellules stromales de la moelle osseuse qui fournissent le RANKL, le M-CSF et les ligands - encore inconnus - des adaptateurs à domaines ITAM. La liaison de RANKL à son récepteur RANK permet à la fois le recrutement de TRAF6, qui active NK-κB et les MAPK, JNK et ERK, et celui de c-Fos qui induit la formation du complexe AP-1. Les facteurs de transcription NK-κB et AP-1 vont alors permettre en partie l’activation de NFATc1, facteur de transcription clé de la différenciation ostéoclastique. Les kinases Btk et Tec sont également activées par RANK après phosphorylation. En parallèle, les adaptateurs DAP12 et FcRγ possèdent dans leur domaine intracellulaire un motif ITAM chargé de deux tyrosines. Après interaction des récepteurs membranaires (TREM-2, OSCAR, MDL-1, SIRPβ - signal-regulatory protein β - et PIRα) avec leurs ligands respectifs et leur association avec leur adaptateur, ces derniers sont phosphorylés par les kinases de la famille Src. Cela entraîne la création de sites d’ancrage permettant le recrutement des tyrosine kinases Syk qui sont alors phosphorylées. L’ensemble induit l’activation de protéines adaptatrices comme BLNK (B cell linker) et SLP-76 qui permettent la formation du complexe de signalisation ostéoclastogénique en recrutant à la fois les kinases Tec et Btk induites par RANK et la PLCγ (phospholipase Cγ). Ce complexe est indispensable à l’augmentation du flux calcique, lui-même nécessaire à l’activation de NFATc1. De nombreuses études concernant NFATc1 ont permis de montrer qu’il régulait directement de nombreux gènes spécifiques des ostéoclastes tels que TRAP, le récepteur à la calcitonine, la cathepsine K, l’intégrine αVβ3 et OSCAR.

Chez l’homme, des mutations dans les gènes codant pour DAP12 et TREM-2 ont été corrélées à une pathologie rare, appelée maladie de Nasu Hakola, observée essentiellement au Japon et en Finlande et caractérisée par des kystes osseux, des fractures, une démence présénile et une mort prématurée. Les précurseurs monocytaires des patients atteints de cette maladie sont incapables de se différencier in vitro en ostéoclastes fonctionnels en présence de M-CSF et de RANKL [ 25]. L’étude des souris déficientes en DAP12 a également mis en évidence l’incapacité des précurseurs ostéoclastiques médullaires ou spléniques à se différencier in vitro en ostéoclastes en présence de M-CSF et RANKL [ 26, 27]. Une modeste différenciation peut néanmoins être obtenue lorsque ces précurseurs sont co-cultivés avec des ostéoblastes. Les souris DAP12^−/− présentent une ostéopétrose liée à un défaut de résorption par les ostéoclastes, présents au niveau de la matrice osseuse, mais incapables de la résorber. Quant aux souris FcRg^−/−, elles ne présentent pas de phénotype osseux. En revanche, les souris double-knock out pour DAP12^−/− et FcRγ^−/− ont une ostéopétrose beaucoup plus sévère que celle des souris DAP12^−/−, caractérisée par une absence d’ostéoclastes. De plus, la co-culture d’ostéoblastes normaux avec des précurseurs médullaires DAP12^−/− FcRγ^−/− n’est pas capable de restaurer leur différenciation ostéoclastique, contrairement à celle des précurseurs DAP12^−/−.

Tous ces résultats montrent que la voie RANK/RANKL est indispensable, mais insuffisante, pour induire la différenciation terminale des ostéoclastes qui requiert des signaux supplémentaires de co-stimulation relayés par les protéines adaptatrices DAP12 et FcRγ. De plus, l’étude des souris DAP12^−/− FcRγ^−/− suggère que les ostéoblastes - par un contact cellule-cellule - apportent un signal essentiel, autre que celui délivré par M-CSF et RANKL, qui passerait par FcRγ en l’absence de DAP12 [ 28]. Cependant, la nature de ce signal reste à ce jour inconnue et son identification s’avère complexe. En effet, les souris déficientes en TREM2 n’ont pas de phénotype ostéopétrotique ni de kystes osseux, ce qui est en contradiction avec les caractéristiques de la maladie de Nasu Hakola [ 29]. Des résultats non publiés, communiqués par Y.W. Choi (University of Pennsylvania School of Medicine, USA) au dernier congrès d’ostéo-immunologie (Rhodes, Juin 2008), montrent que la double inactivation de TREM-2 et d’OSCAR n’entraîne aucun phénotype osseux chez la souris. Ces résultats en apparence contradictoires conduisent à conclure que le rôle des adaptateurs DAP12 et FcRγ est essentiel dans l’ostéoclastogenèse et que ces adaptateurs sont activés par plusieurs récepteurs - en plus de TREM2 et d’OSCAR -, via des ligands qui restent à découvrir.

Afin d’identifier les molécules activées par RANK et capables de stimuler le signal calcique en réponse à l’activation par phosphorylation de la protéine phospholipase C γ (PLCγ), les auteurs se sont intéressés aux tyrosine kinases fortement exprimées par les ostéoclastes. C’est une étude transcriptomique qui a ainsi permis d’identifier les tyrosine kinases Tec et Btk (Bruton tyrosine kinase), dont le rôle avait été surtout étudié dans les lymphocytes. Les souris déficientes en Tec n’ayant pas de phénotype osseux et celles dépourvues de Btk n’ayant qu’une très légère ostéopétrose, l’étude s’est concentrée sur l’analyse des souris ayant une double délétion Tec^−/− Btk^−/−. Ces dernières développent une ostéopétrose sévère, caractérisée par un défaut de résorption dû à une altération de la différenciation ostéoclastique. Les auteurs démontrent que le défaut de différenciation des précurseurs médullaires de souris Tec^−/− Btk^−/− a une origine intrinsèque. Dans les cellules Tec^−/− Btk^−/−, la phosphorylation des tyrosines de la PLCγ, ainsi que les oscillations de calcium nécessaires à l’induction en aval de NFATc1, sont fortement altérées, tandis que les auteurs observent un niveau normal d’expression des MAPK (ERK, JNK, p38) en aval de TRAF6. Ces résultats convergent et orientent vers un rôle de Btk et Tec dans la phosphorylation des PLCγ et, donc, dans l’intégration des signaux induits par RANK et vers un rôle du signal calcique induit par les adaptateurs à domaine ITAM. Plus précisément, les auteurs montrent que c’est l’activation de Btk par RANK et celle de BLNK (B cell linker, adaptateur phosphorylé par Syk) par les signaux des immunorécepteurs à domaine ITAM, qui permet la formation du complexe Btk/BLNK, induisant ainsi l’activation de NFATc1. Cependant, le fait que les cellules BLNK^−/− n’aient aucun défaut de différenciation ostéoclastique suggère un effet compensatoire d’autres protéines comme SLP76, protéine adaptatrice homologue à BLNK dans les lymphocytes T. Par ailleurs, chez l’homme, des mutations dans le gène codant pour Btk induisent un défaut dans le développement des cellules B, ainsi qu’une réduction de la densité osseuse.

Outre la connexion entre deux voies de signalisation, les tyrosine kinases Bruton et Tec établissent ainsi, une fois de plus, un lien entre les systèmes immunitaire et osseux, donnant de ce fait une vision intégrée de ces deux systèmes jusqu’à très récemment encore considérés comme indépendants.

Nous avons vu que les ostéoclastes des souris DAP12^−/− sont incapables de résorber l’os et qu’ils sont absents des souris DAP12^−/− FcRγ^−/−. Pourtant, l’ovariectomie des femelles, mimant une situation de carence estrogénique, entraîne une ostéoporose qui diffère selon les sites osseux étudiés. Ainsi, l’on observe une importante perte osseuse induite après ovariectomie au niveau de l’os trabéculaire des os longs, traduisant une réactivation des ostéoclastes, tandis qu’elle est bloquée au niveau des vertèbres et de l’os cortical [ 31, 32]. Ces résultats suggèrent que des variations d’expression de l’un et/ou de l’autre des adaptateurs ont des répercussions locales différentes et qu’il existe probablement des voies de signalisation alternatives qui sont engagées en fonction des interactions avec le microenvironnement, afin d’induire le remodelage osseux [ 33]. Ces résultats limitent donc considérablement l’utilisation de stratégies visant à réprimer les adaptateurs pour combattre certaines pathologies comme l’ostéoporose. À l’inverse, les données du groupe de H. Takayanagi montrent que les souris Tec^−/− Btk^−/− sont légèrement protégées de la perte osseuse induite après ovariectomie, mais surtout qu’elles sont protégées de la perte osseuse induite dans un modèle inflammatoire murin après injection de LPS (lipopolysaccharide) [30]. Ces auteurs spéculent donc avec raison sur le développement d’une stratégie thérapeutique visant à réprimer l’ostéoclastogenèse in vivo dans des situations pathologiques comme l’ostéoporose ou la polyarthrite rhumatoïde, en inactivant Tec grâce notamment à l’utilisation d’inhibiteurs comme LFM-A13.