L’utilisation de vecteurs construits à partir des oncorétrovirus avec comme objectif l’expression permanente et/ou ciblée d’un gène d’intérêt dans un organisme a été le plus souvent décevante. En effet, les études réalisées avec ces vecteurs ont montré une inhibition (silencing) de la transcription du gène au cours du développement et/ou de la différenciation. L’espoir renaît grâce aux vecteurs lentiviraux. Ces derniers - capables de transduire des cellules ne se divisant pas [1] - viennent de faire une irruption remarquable dans le domaine de la transgenèse, comme le montrent les travaux récemment publiés [2, 3]. Les auteurs de ces travaux ont en effet obtenu des souris transgéniques pour le gène codant pour la GFP (green fluorescent protein) grâce à l’utilisation de particules lentivirales recombinantes. Ces dernières ont été obtenues après cotransfection dans les cellules 293 d’un vecteur lentiviral (Figure 1), d’un vecteur d’empaquetage et du vecteur VSV-G exprimant la glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire. Le premier de ces articles montre l’expression de la GFP au cours de la différenciation des cellules souches embryonnaires (ES) murines en corps embryoïdes [2]. De même, la GFP est exprimée dans les tissus des souris nées après transfert dans des blastocystes des cellules ES ainsi transduites. Le deuxième article rapporte que des souris transgéniques pour la GFP ont été obtenues, soit par micro-injection de la suspension virale, concentrée par ultracentrifugation, dans l’espace périvitellin des embryons unicellulaires, soit par incubation de tels embryons, d’abord débarrassés de la zone pellucide, dans cette suspension [3]. Les embryons sont ensuite cultivés pendant 3 jours, puis implantés au stade gastrula ou morula dans des mères porteuses. À la naissance des souriceaux, l’évaluation du nombre de copies du transgène intégré et de l’expression de la GFP indique que les animaux qui expriment la GFP contiennent au moins une copie dutransgène et que l’intensité de la fluorescence est positivement corrélée avec le nombre de copies. Si le pourcentage de succès dans l’implantation est significativement plus élevé, lorsque le virus est transféré par micro-injection que lorsqu’il l’est après incubation, cette dernière approche permet d’établir une corrélation positive entre le nombre d’intégrations provirales et celui des particules infectieuses. Bien entendu, les auteurs ont vérifié que la majorité des animaux (F1) nés du croisement de parents transgéniques expriment la GFP à un niveau égal à celui de ces derniers, ce qui valide l’hypothèse selon laquelle le provirus n’est pas inactivé au cours de la gamétogenèse. Si dans le vecteur lentiviral, le gène de la GFP est placé sous le contrôle d’un promoteur dont l’activité est spécifique d’un tissu, il est alors possible de cibler l’expression du transgène dans ce tissu. Ainsi, la GFP n’est exprimée que dans les cellules du muscle squelettique, quand le transgène est sous le contrôle du promoteur de la myogénine ou dans le thymus, quand son expression dépend du promoteur proximal du gène lck spécifique. La transgenèse par vecteur lentiviral, en évitant la micro-manipulation toujours délicate du pronucléus, devrait permettre l’introduction d’un transgène dans les embryons d’autres espèces animales (l’article présente les premiers résultats obtenus chez le rat). De plus, l’incubation des embryons dans la suspension virale propose une approche économique et fiable, facile à mettre en œuvre, et donc accessible à de nombreux laboratoires. Soulignons toutefois que la transgenèse lentivirale reste cependant restreinte à des transgènes de moins de 10 kb.

Figure I. Structure du vecteur lentiviral et du provirus. La transcription du vecteur lentiviral utilisé, construit à partir du provirus VIH (virus de l’immunodéficience humaine) est contrôlée par le promoteur du cytomégalovirus inséré à la place de la région U3 du LTR (long terminal repeat) 5’. Elle est amorcée au début de la région R 5’ et l’ARN viral est coupé/polyadénylé à la limite R/U5 dans le LTR 3’. L’insertion en 5 ’ d’une séquence nucléotidique dite « élément flap » (formé au cours de la transcription inverse du VIH) facilite l’entrée du génome viral dans le noyau, permettant ainsi d’accroître la production virale. Le gène codant pour la GFP est placé sous le contrôle d’un promoteur interne, celui de l’ubiquitine-C humaine. En 3’ est inséré l’élément régulateur post-transcriptionnel du virus de l’hépatite de la marmotte (WPRE), qui facilite la sortie des ARN messagers dans le cytoplasme. Ce vecteur est dit auto-inactivant, car la région U3 du LTR 3’ a été inactivée par une délétion (∆U3). Après transcription inverse, ∆U3 est dupliquée dans le LTR 5’, ce qui conduit à l’inactivation transcriptionnelle du provirus intégré. Ainsi, dans les cellules transduites par les particules lentivirales recombinantes, les seuls ARNm exprimés sont ceux amorcés au niveau du promoteur interne dans le provirus.

Figure I. Structure du vecteur lentiviral et du provirus. La transcription du vecteur lentiviral utilisé, construit à partir du provirus VIH (virus de l’immunodéficience humaine) est contrôlée par le promoteur du cytomégalovirus inséré à la place de la région U3 du LTR (long terminal repeat) 5’. Elle est amorcée au début de la région R 5’ et l’ARN viral est coupé/polyadénylé à la limite R/U5 dans le LTR 3’. L’insertion en 5 ’ d’une séquence nucléotidique dite « élément flap » (formé au cours de la transcription inverse du VIH) facilite l’entrée du génome viral dans le noyau, permettant ainsi d’accroître la production virale. Le gène codant pour la GFP est placé sous le contrôle d’un promoteur interne, celui de l’ubiquitine-C humaine. En 3’ est inséré l’élément régulateur post-transcriptionnel du virus de l’hépatite de la marmotte (WPRE), qui facilite la sortie des ARN messagers dans le cytoplasme. Ce vecteur est dit auto-inactivant, car la région U3 du LTR 3’ a été inactivée par une délétion (∆U3). Après transcription inverse, ∆U3 est dupliquée dans le LTR 5’, ce qui conduit à l’inactivation transcriptionnelle du provirus intégré. Ainsi, dans les cellules transduites par les particules lentivirales recombinantes, les seuls ARNm exprimés sont ceux amorcés au niveau du promoteur interne dans le provirus.

Comme nous l’avons souligné, ces travaux sont remarquables par le fait que l’expression du vecteur lentiviral ne s’éteint pas au cours des différentes étapes du développement, à l’inverse de celle des vecteurs oncorétroviraux. Comme les vecteurs lentiviraux utilisés dans ces travaux sont auto-inactivants, on ne peut exclure la possibilité que la délétion introduite dans la région U3, en entraînant l’inactivation transcriptionnelle des LTR du provirus, isole le transgène des effets négatifs dus au site d’intégration, et/ou empêche les inhibitions épigénétiques, comme la méthylation. Il resterait alors à vérifier que des vecteurs oncorétroviraux auto-inactivants ne seront pas soumis à une telle inhibition. Il se pourrait également que l’élimination de séquences dans les LTR empêche la fixation de facteurs transrépresseurs et explique les résultats obtenus. Les auteurs proposent aussi que les mécanismes celluaires spécifiques de l’inhibition de l’activité des oncorétrovirus endogène seraient inefficaces pour lutter contr es infections par les lentivirus. D’autan plus que des lentivirus endogènes n’on pas été identifiés. Si l’utilisation de vec teurs lentiviraux auto-inactivants représente une avancée majeure dans l domaine de la transgenèse chez la souris, la transduction réussie de gène d’intérêt dans des cellules ES humaine indique que ces vecteurs ont un potentie pour le développement des thérapie génique et cellulaire [2].