Au début des années 2000, Itskovitz-Eldor et al . ont montré la capacité des cellules souches embryonnaires humaines (hESC, human embryonic stem cells ), cultivées en suspension, à s’agréger en corps embryoïdes, puis à acquérir des marqueurs spécifiques des trois couches germinales embryonnaires [ 5 ]. Ces observations ouvraient ainsi la voie à de nombreuses études sur le développement embryonnaire humain, puis au développement d’un système de culture cellulaire en trois dimensions, les organoïdes, possédant des caractéristiques structurelles et fonctionnelles de l’organe en développement qu’ils représentent. Les iPSC furent ensuite utilisées afin de produire des organoïdes représentatifs de différents organes : la peau, le poumon, le foie, ou le cerveau [ 6 ] (→).

(→) Voir la Synthèse de H. Chneiweiss et al ., m/s n° 11, novembre 2023 et voir la série Organoïdes

Le premier modèle d’organoïde cérébral doté d’une formation auto-organisée, avec une polarité apico-basale, et représentant les aspects spatio-temporels de la corticogenèse précoce, a été obtenu par Eiraku et al ., en 2008, à partir de hESC [ 7 ]. Peu après, en 2013, Lancaster et al . décrivirent un protocole permettant la génération d’organoïdes cérébraux à partir d’iPSC [ 8 ]. Ces organoïdes reproduisaient le développement cérébral humain fœtal, avec une auto-organisation qui débute par une prolifération des progéniteurs neuronaux, suivie de leur différenciation en différents types de neurones fonctionnels, en oligodentrocytes et en astrocytes [ 9 ].

Deux types d’organoïdes cérébraux peuvent être produits. Il est en effet possible de produire des organoïdes cérébraux dits « entiers », composés de plusieurs régions du cerveau (régions corticales, ventricules, hippocampe, plexus choroïde), ou des organoïdes guidés vers une région spécifique (région cérébrale postérieure ou antérieure, cervelet, hypothalamus, cortex) [ 10 ]. Techniquement, l’approche guidée est la plus robuste et elle permet une meilleure reproductibilité, mais elle est restreinte à la partie cérébrale ciblée, qui se trouve ainsi dépourvue de connexions avec les autres régions du cerveau.

Grâce à des systèmes de co-culture, apportant une contrainte de forte proximité, il est désormais possible de produire des assembloïdes, qui résultent de la fusion d’au moins deux organoïdes guidés, chacun étant representatif d’une région spécifique d’un tissu, ou de tissus différents. Les premiers assembloïdes cérébraux ont été produits en 2017, par l’équipe de Sergiu P Pas¸ca ( Stanford University School of Medicine , Stanford, États-Unis) [ 11 ] puis par celle de Juergen A Knoblich ( Institute of Molecular Biotechnology , Vienne, Autriche) [ 12 ], en produisant des organoïdes correspondant aux zones ventrale et dorsale du cerveau antérieur, puis en les co-cultivant pour qu’ils fusionnent. Cette approche a permis d’étudier les dynamiques inter-régions, reflétant les migrations se produisant au cours du développement cérébral embryonnaire, comme la migration des interneurones (principalement GABAergiques) nés dans la zone ventrale et devant migrer dans la zone dorsale. Grâce à cette approche, l’équipe de Sergiu Pas¸ca a pu montrer l’utilité des assembloïdes en pathologie cérébrale pour comprendre les mécanismes cellulaires impliqués. Utilisant des assembloïdes produits à partir d’iPSC de patients, ils ont en effet modélisé le syndrome de Thimoty, causé par des variations gain-defonction dans le gène CACNA1C ( calcium voltage-gated channel subunit alpha1 C ) qui code les canaux calciques de type L, responsables, entre autres, d’épilepsie, de TSA, de retard de développement, et ont mis en évidence une altération de la migration des interneurones, celle-ci pouvant être restaurée en bloquant l’activité des canaux calciques de type L par des molécules pharmacologiques spécifiques. Toujours dans l’équipe de Sergiu Pas¸ca, Andersen et al ., ont produit des assembloïdes constitués d’organoïdes de cortex cérébral, de cerveau postérieur avec moelle spinale, et de muscle squelettique, et recréé ainsi in vitro un axe fonctionnel dans lequel l’activation des neurones corticaux contrôle la contraction musculaire via les motoneurones, un modèle qui ouvre de nouvelles perspectives pour l’étude et le traitement des maladies associées à des troubles moteurs [ 13 ].

L’utilisation d’organoïdes cérébraux a permis de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement normal du cerveau, et de les confronter à ceux observés en conditions pathologiques, dans le but de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques et d’élaborer des traitements personnalisés. Différentes maladies, d’origine génétique ou pas, sont étudiées grâce aux organoïdes cérébraux, notamment :

• des défauts cérébraux résultant d’une infection virale, due au virus Zika [ 14 ], au SARS-CoV-2 ( severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ) [ 15 ], au virus Herpès simplex [ 14 ], etc. Dans le cas du virus Zika, les organoïdes ont permis de comprendre comment le virus pénètre dans les progéniteurs neuraux et entraîne leur apoptose, avec pour conséquence une microcéphalie. Ces études ont également montré l’existence de mécanismes pathogènes communs aux microcéphalies induites par plusieurs virus et de tester des stratégies antivirales.
• des maladies génétiques neurodéveloppementales, comme la trisomie 21 [ 16 ], le syndrome de l’X-fragile [ 17 ], le syndrome de DiGeorge [ 18 ], le syndrome de Pitt-Hopkins [ 19 ], mais également des troubles du spectre autistique pour lesquels les causes génétiques ont été identifiées, comme des mutations des gènes KMT5B ( lysine methyltransferase 5B ), CHD8 ( chromodomain helicase DNA binding protein 8 ) et CNTNAP2 ( contactin-associated protein 2 ) [ 20 ]. Ces études ont permis de consolider les connaissances acquises à partir des modèles animaux ou des cultures cellulaires en deux dimensions. Elles ont aussi permis de caractériser de nouveaux mécanismes clés impliqués dans la pathogénèse de ces maladies, et de tester des stratégies pour corriger les phénotypes pathologiques.
• Même si les organoïdes cérébraux sont surtout reconnus comme des outils de choix pour les études du neurodéveloppement, ils sont aussi d’un intérêt majeur pour les maladies neurodégénératives, avec des études réalisées sur des organoïdes issus de cellules de patients présentant une maladie de Parkinson, avec ou sans cause génétique connue (par exemple, impliquant les gènes LRRK2 [ leucine-rich repeat kinase 2 ] [ 21 ] et SNCA [ synuclein alpha ] [ 22 ]), ou une maladie d’Alzheimer (impliquant PSEN1 [ presenilin 1 ] [ 23 ]). Pour la maladie d’Alzheimer, le modèle d’organoïde cérébral reproduit les défauts caractéristiques de la maladie, comme l’agrégation de la protéine amyloïde et l’hyperphosphorylation de la protéine Tau. Le succès de l’utilisation de molécules pharmacologiques dont les effets sur la réduction des agrégats amyloïdes sont connus (telles que les inhibiteurs des sécrétases J et E) suggère que les organoïdes cérébraux représentent un bon modèle pour l’identification de nouvelles molécules thérapeutiques dans cette maladie. Des tests de criblage de molécules à haut débit ont déjà été réalisés, et sont en cours d’optimisation pour proposer une médecine personnalisée de précision [ 24 ].
• les tumeurs cérébrales, comme le glioblastome ou le médulloblastome [ 25 , 26 ].
• les maladies mentales, comme la schizophrénie (avec les mutations du gène DISC1 [ disrupted-in-schizophrenia 1 ] [ 27 ])
• les maladies résultant d’expositions à des toxines [ 9 , 28 ], ou l’impact, sur le développement cérébral fœtal, d’une exposition in utero à des antidépresseurs [ 29 ], à l’alcool, à la cocaïne, à la méthamphétamine, pris par la mère au cours de la grossesse [ 30 ]. Plus spécifiques que les tests classiques d’embryotoxicité réalisés in vitro , les organoïdes cérébraux permettent de tester la neurotoxicité embryonnaire de médicaments, de substances chimiques ou illicites, avec des temps d’exposition prolongés, ou à des temps précis du développement de l’organoïde, et de compléter cette étude par des analyses morphologiques, transcriptionnelles et fonctionnelles.

La modélisation d’un tissu reposant sur des organoïdes présente plusieurs avantages : les organoïdes permettent d’obtenir une complexité et une maturité cellulaire plus importante que celles obtenues dans un modèle en 2D ; ils permettent de pallier les limites des modèles animaux, qui ne reproduisent pas toujours fidèlement certaines caractéristiques des cerveaux humains, en raison de différences de régulation du cycle cellulaire des progéniteurs neuronaux, des voies de signalisation ou de migration cellulaire [ 31 ]. L’approche par organoïdes cérébraux possède néanmoins ses limites. Le cerveau humain se caractérise par une taille et une architecture spécifiques. Il contient un nombre important de neurones, de différents types, qui établissent des connexions pour former un réseau complexe et mature capable d’intégrer les modifications de l’environnement. L’organoïde cérébral est un outil qui reste limité à l’échelle du millimètre, correspondant au cerveau d’un insecte, et qui est constitué d’un nombre réduit de neurones. Loin de recréer les six couches du néocortex humain, il possède une architecture globale bien différente, mais qui, à l’échelle microscopique, reproduit le développement cérébral, avec plusieurs couches de neurones de différentes identités. Des cellules microgliales, capables de réponses immunitaires, peuvent ainsi être observées dans des organoïdes cérébraux [ 32 ]. Mais bien que ses neurones soient actifs, l’organoïde reste très immature, et son réseau neuronal est loin d’avoir la complexité de celui du cerveau humain.

L’absence de vascularisation est l’un des défis importants qu’il est nécessaire de relever : sans vascularisation, l’oxygène et les nutriments sont apportés aux cellules directement par diffusion. Au cours de la croissance de l’organoïde, l’efficacité de cette diffusion vers son centre diminue, le mettant en hypoxie et lui apportant moins de nutriments. Inévitablement, un stress, puis une mort cellulaire par nécrose sont donc observés au centre de l’organoïde, rendant toute exploitation impossible. Durant ces cinq dernières années, plusieurs équipes ont cherché à produire des organoïdes vascularisés : en les transplantant dans des cerveaux de souris pour « capter » leur vascularisation ; en réalisant des co-cultures en présence de cellules endothéliales de veines ombilicales humaines, puis en les transplantant dans des cerveaux de souris ; ou en les cultivant avec des organoïdes de vaisseaux sanguins [ 33 ]. Une approche différente, récemment décrite par Qian et al . [ 34 ], consiste à réaliser des coupes d’organoïdes corticaux épaisses de 500 μm, qui peuvent être répétées toutes les 4 semaines, afin de faciliter le contact du centre de l’organoïde avec le milieu de culture et ses nutriments, prévenant ainsi la mort des cellules et maintenant la neurogénèse et le développement du cortex à un stade du développement équivalent à celui du troisième trimestre de grossesse dans l’espèce humaine. La culture de coupes d’organoïdes dans un système d’interface air-liquide permet également de prolonger la vie de l’organoïde, avec une amélioration de la survie des neurones et une croissance des axones efficace et fonctionnelle [ 35 ]. Très récemment, Dao et al . ont produit des assembloïdes en associant des organoïdes cérébraux et des organoïdes de vaisseaux sanguins, créant ainsi des organoïdes vascularisés qui acquièrent des fonctions biologiques spécifiques de la barrière hémato-encéphalique [ 36 ].

Outre les limites et les défis expérimentaux, l’utilisation des organoïdes cérébraux pose des questions éthiques[ 37 – 40 ]. Les premiers questionnements éthiques sont classiques en recherche sur l’homme : ils concernent l’utilisation de matériel humain, le consentement des patients pour la production d’iPSC à partir d’une biopsie de peau ou d’une prise de sang, le consentement sur le devenir de leurs iPSC en organoïdes cérébraux pour la recherche fondamentale, la médecine personnalisée, etc. Plus spécifiquement, les organoïdes cérébraux issus de ces prélèvements peuvent être transférés dans des modèles animaux chimériques, ou assemblés avec d’autres organoïdes en complexes de statut moral ou juridique mal défini. Bien que non envisageable aujourd’hui, la possibilité que, grâce aux évolutions techniques, les organoïdes cérébraux puissent, un jour, être dotés d’une conscience est une question qui est néanmoins débattue ⁴ [ 47 ] (→)

(→) Voir l’Éditorial de H. Chneiweiss, m/s n° 2, février 2020, page 99

En effet, la présence, par exemple, de l’hippocampe, structure cérébrale impliquée dans la mémoire, et celle de connections neuronales actives, détectées par des enregistrements d’activités électriques et ressemblant à celles d’un cerveau fœtal en développement, ont conduit les scientifiques, les philosophes, mais aussi le grand public, à débattre de cette question de la « conscience des organoïdes cérébraux ». Quel statut moral doit-on donc leur accorder ? Quelles seront les capacités cognitives dont seront dotées les prochaines générations d’organoïdes cérébraux, alors probablement couplés à l’intelligence artificielle ?

La taille de l’organoïde au cours de son développement ( Figure 4A ) est un critère important qui peut permettre de confirmer l’implication d’un variant génétique dans le cas de l’étude d’anomalies de taille du cerveau, comme la microcéphalie [ 43 ] ou la mégalencéphalie [ 44 ]. Des immunomarquages, réalisés sur des coupes d’organoïdes, peuvent ensuite révéler des pistes pour comprendre les mécanismes impliqués. Il est ainsi possible d’observer, avec les différents marqueurs, un nombre important de rosettes avec une zone ventriculaire (exprimant PAX6 [ paired box 6 ]) et des zones corticales ( Figure 4B ). La prolifération des progéniteurs (révélée par le marqueur Ki67) et leur axe de division (visualisé par HTA28 [ histone H3 phospho Ser28 ] et Tpx2 [ targeting protein for Xklp2 ]), ainsi que la mise en place des différentes structures à identité neuronale spécifique (PAX6 pour les progéniteurs, TBR1 [ T-brain transcription factor 1 ] / TUJ1 [ class III beta-tubulin ] / SATB2 [ special AT-rich sequence-binding protein 2 ] / CTIP2 [ coup-TFI interacting protein 2 ] pour les neurones à apparition précoce ou tardive, ou GFAP [ glial fibrillary acidic protein ] pour les astrocytes) peuvent également être visualisées ( Figure 4C, D ). Les résultats de ces immunomarquages permettent d’élaborer des hypothèses quant aux mécanismes impliqués dans ces maladies. Ainsi, une diminution de la prolifération des progéniteurs neuronaux, associée à leur différenciation accélérée en neurones, peut être le reflet in vitro d’une microcéphalie. À l’inverse, une prolifération exagérée des progéniteurs associée à un retard de la différenciation neuronale orientera vers une mégalencéphalie.

Après 12 semaines de culture, l’organoïde cérébral est doté d’activité électrique spontanée. Cette activité peut être mesurée par la technique de puces à microélectrodes (MEA) : l’organoïde est déposé sur une micropuce ( 3Brain ) ⁶ permettant l’enregistrement des pics d’activité électrique produite par les neurones qui le constituent ( Figure 4E ). La fréquence et l’intensité de ces pics survenant spontanément ou après stimulation électrique ou chimique sont enregistrées. Ce système permet ainsi de tester l’effet de molécules à potentiel pharmacologique sur l’activité des cellules.

Des analyses transcriptomiques, réalisées par séquençage de l’ARN sur cellule unique (scRNA-seq), permettent d’évaluer l’expression des gènes dans chaque type cellulaire composant l’organoïde. Il est ainsi possible de définir l’identité de chacune des cellules, les voies de différenciation qui sont activées, et le devenir des cellules, et ainsi d’appréhender l’impact possible d’une variation génétique sur le développement du cerveau. Les résultats de ces analyses permettent de définir des groupes de cellules composant l’organoïde, selon leur profil transcriptomique, et ainsi d’identifier les divergences à l’échelle de la cellule et à l’échelle de l’organoïde.

La protéine PTBP1 ( polypyrimidine tract-binding protein 1 ) est une protéine de liaison à l’ARN qui participe à la régulation de l’epissage alternatif. Ce facteur d’épissage navigue entre le noyau et le cytoplasme grâce à la présence, à son extrémité N-terminale, d’une séquence de localisation nucléaire (NLS) et d’une séquence d’exportation nucléaire (NES). Des variations pathogènes, apparues de novo ou héritées, et affectant la localisation de cette protéine, ont été trouvées chez 23 individus présentant un nouveau syndrome caractérisé par différents troubles du neurodéveloppement. Les études in vivo , réalisées chez le poisson zèbre, et in vitro sur des fibroblastes de patients ou de souris (cellules NIH-3T3) dans lesquels les variations pathogènes ont été introduites, ont mis en évidence plusieurs défauts cellulaires. Les études actuelles consistent à produire des organoïdes cérébraux à partir d’iPSC de patients afin d’en définir la morphologie, et de les caractériser histologiquement et fonctionnellement. La technique de séquençage de l’ARN sur cellule unique, réalisée au cours du développement de l’organoïde, apporte des informations quant aux trajectoires développementales qui sont affectées par la mutation. Un modèle murin dans lequel la mutation humaine la plus fréquente est introduite ( knock-in ) complète cette analyse avec l’étude du développement embryonnaire du cerveau. Ce modèle permet en outre de comparer les effets des variations génétiques d’intérêt entre espèces (homme/souris). Ce type d’étude, associant plusieurs méthodes et modèles complémentaires, est essentiel pour accroître les connaissances sur la fonction de la protéine étudiée et sur le développement sain et pathologique du cerveau, et ainsi comprendre la cause des symptômes des patients, avec à long terme, la perspective de thérapies ciblées.

Le gène PIK3CA ( phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase, catalytic subunit alpha ) code la sousunité catalytique p110D de la PI3K ( phosphatidylinositol 3-kinase ), une protéine kinase impliquée dans les premières étapes de phosphorylation de la voie de signalisation PI3K/AKT (protéine kinase B)/mTOR ( mammalian target of rapamycin ), une voie très importante dans la prolifération et le métabolisme cellulaires. Cette voie est souvent ciblée par les thérapies utilisées dans de nombreux cancers. Elle est également l’objet d’essais cliniques réalisés dans le cadre de maladies rares, comme les syndromes avec hypercroissance découlant de variations dans PIK3CA (syndromes PROS, pour PIK3CA -related overgrowth syndromes ) [ 45 ]. Parmi ces syndromes, le syndrome MCAP ( megalencephaly-capillary malformation-polymicrogyria , MIM ^7, # 602501) est caractérisé par une mégalencéphalie ^8, et une polymicrogyrie ⁹ , associées ou non à des retards cognitifs et moteurs, des malformations vasculaires des parties molles, et des anomalies distales des membres. Les variations de PIK3CA sont principalement post-zygotiques, mais elles peuvent être constitutives dans de très rares cas. Grâce à l’engagement de notre équipe auprès des patients PROS (collaborations nationales et internationales pour le diagnostic, le suivi, les essais cliniques et les études fonctionnelles in vitro ), des iPSC, issues d’une patiente de 3 ans souffrant du syndrome MCAP résultant d’une mutation constitutive de PIK3CA , ont été obtenues par reprogrammation des cellules sanguines mononucléées de la patiente. Une des hypothèses pour expliquer l’apparition de ce syndrome est l’existence d’une prolifération exagérée des progéniteurs neuraux, due à l’activation constitutive de PIK3CA et, par conséquent, à celle permanente de la voie PI3K/AKT/mTOR. Cette prolifération exagérée associée à un retard de différenciation pourrait être l’explication de la mégalencéphalie. Cette étude constitue une preuve de concept pour l’utilisation des organoïdes cérébraux dans l’avancée de la recherche de thérapies pour les TND et comme modèles précliniques pertinents. Elle est liée à l’essai clinique SESAM (dont le promoteur est le CHU de Dijon). Il s’agit d’un essai multicentrique de phase II, en double aveugle, contrôlé par placebo, visant à évaluer la sécurité et l’efficacité de l’alpelisib (BYL719), inhibiteur de la phosphatidylinositol-3-kinase, chez les patients pédiatriques et adultes atteints du syndrome MCAP. Cette molécule, ou d’autres molécules non encore testées chez l’homme mais connues pour leur efficacité in vitro , comme le triptolide [ 46 ], seront testées sur les organoïdes cérébraux produits, dans l’espoir d’en corriger le phénotype.