CRIPSR-Cas9

Les dystrophies musculaires liées au gène LMNA sont des maladies autosomiques dominantes progressives. Les mutations faux-sens peuvent y être corrigées grâce aux outils développés pour l’édition génomique, comme le système CRISPR/Cas9. L'évaluation fonctionnelle de l’efficacité de la correction d’une telle mutation reste complexe car aucune perte de fonction de la protéine n’est observée dans les cellules de patients. Les protéines codées par le gène LMNA, les lamines A et C, sont des protéines majeures et ubiquitaires de l’enveloppe nucléaire mais ne sont pas spontanément exprimées dans les cellules souches pluripotentes (iPSC). Wang et al. [ 1 ] ont induit l’expression des lamines A/C dans des cellules souches pluripotentes (iPSC) dérivées de deux patients. Ceux-ci présentaient une dystrophie musculaire liée au gène LMNA avec deux variants distincts : c. 1366A>G, p.(Asn456Asp) et c.1494G>T, p.(Trp498Cys). Il s‘agissait en l’occurrence d’un bref protocole de différenciation par ajout de sérum. Les profils d’expression de gènes co-régulés avec le gène LMNA ont ensuite été analysés, tels COL1A2 et S100A6 . L’édition précise de la mutation LMNA c.1366A>G a été réalisée à l’aide d’un outil dérivé de l’éditeur de base cytosine ( Cytosine Base Editor , CBE), une version modifiée du système CRISPR-Cas9 classique. La mutation a pu être corrigée avec une efficacité de 100 % dans des clones iPSC dérivés de cellules de patients. Le protocole de différenciation rapide a permis d’avoir un marqueur fonctionnel et de démontrer ainsi l’augmentation de l’expression des lamines A/C et de la normalisation de l’expression des gènes co-régulés.

Commentaire

Le système CRIPSR/Cas9 est une technique de pointe qui permet de modifier précisément le génome. Ce système est à l’origine de nombreuses stratégies thérapeutiques y compris pour les dystrophies musculaires [ 2 ]. Ce système est en partie basé sur la reconnaissance par l'enzyme cas9 d'une séquence spécifique appelée PAM ( 3’Protospacer Adjacent Motif ), située en aval de la séquence cible, permettant à l’enzyme de couper l’ADN et d’initier le mécanisme de réparation. Cette séquence PAM doit se situer directement après la séquence cible et le motif le plus couramment utilisé est le motif 5’-NGG-3’ (où N = A, C, G ou T), limitant fortement l’application de ce système. Pour se libérer de cette contrainte, Wang et al ont utilisé une Cas9 modifiée qui reconnaît deux types de motifs 5’-NYN-3’/5’-NRN-3’ (où Y = C ou T ; R = A ou T), appelée « near-PAMless cytosine base editor » [ 3 ]. Cette modification permet d’étendre le champ d’application à la presque totalité du génome en reconnaissant plus de séquences. Dans l’étude présentée, les auteurs ont testé cet outil dans les laminopathies et ont montré son efficacité sur des cellules souches pluripotentes issues d’un patient porteur d’une mutation faux-sens dans le gène LMNA . Ils ont réussi à corriger la mutation LMNA c.1366A>G dans l’ensemble des clones générés, aboutissant à une restauration partielle de l’expression des gènes LMNA et S100A6 , un gène co-régulé avec le gène LMNA pendant le développement. Grâce à cette stratégie, les auteurs estiment pouvoir corriger 40 % des mutations faux-sens des dystrophies musculaires liées au gène LMNA .


		Med Sci (Paris). 39: 65. doi: 10.1051/medsci/2023139. CRIPSR-Cas9 Une stratégie thérapeutique pour les laminopathies ? Louise Benarroch¹^* ¹Sorbonne Université, Inserm, Institut de Myologie, Centre de Recherche en Myologie , Paris , France Corresponding author. ^*louise.benarroch@inserm.fr MeSH keywords: Humains, Systèmes CRISPR-Cas, Édition de gène, Laminopathies, Lamine A, génétique
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Top Résumé Liens d’intérêt References		Résumé Les dystrophies musculaires liées au gène LMNA sont des maladies autosomiques dominantes progressives. Les mutations faux-sens peuvent y être corrigées grâce aux outils développés pour l’édition génomique, comme le système CRISPR/Cas9. L'évaluation fonctionnelle de l’efficacité de la correction d’une telle mutation reste complexe car aucune perte de fonction de la protéine n’est observée dans les cellules de patients. Les protéines codées par le gène LMNA, les lamines A et C, sont des protéines majeures et ubiquitaires de l’enveloppe nucléaire mais ne sont pas spontanément exprimées dans les cellules souches pluripotentes (iPSC). Wang et al. [ 1 ] ont induit l’expression des lamines A/C dans des cellules souches pluripotentes (iPSC) dérivées de deux patients. Ceux-ci présentaient une dystrophie musculaire liée au gène LMNA avec deux variants distincts : c. 1366A>G, p.(Asn456Asp) et c.1494G>T, p.(Trp498Cys). Il s‘agissait en l’occurrence d’un bref protocole de différenciation par ajout de sérum. Les profils d’expression de gènes co-régulés avec le gène LMNA ont ensuite été analysés, tels COL1A2 et S100A6 . L’édition précise de la mutation LMNA c.1366A>G a été réalisée à l’aide d’un outil dérivé de l’éditeur de base cytosine ( Cytosine Base Editor , CBE), une version modifiée du système CRISPR-Cas9 classique. La mutation a pu être corrigée avec une efficacité de 100 % dans des clones iPSC dérivés de cellules de patients. Le protocole de différenciation rapide a permis d’avoir un marqueur fonctionnel et de démontrer ainsi l’augmentation de l’expression des lamines A/C et de la normalisation de l’expression des gènes co-régulés. Commentaire Le système CRIPSR/Cas9 est une technique de pointe qui permet de modifier précisément le génome. Ce système est à l’origine de nombreuses stratégies thérapeutiques y compris pour les dystrophies musculaires [ 2 ]. Ce système est en partie basé sur la reconnaissance par l'enzyme cas9 d'une séquence spécifique appelée PAM ( 3’Protospacer Adjacent Motif ), située en aval de la séquence cible, permettant à l’enzyme de couper l’ADN et d’initier le mécanisme de réparation. Cette séquence PAM doit se situer directement après la séquence cible et le motif le plus couramment utilisé est le motif 5’-NGG-3’ (où N = A, C, G ou T), limitant fortement l’application de ce système. Pour se libérer de cette contrainte, Wang et al ont utilisé une Cas9 modifiée qui reconnaît deux types de motifs 5’-NYN-3’/5’-NRN-3’ (où Y = C ou T ; R = A ou T), appelée « near-PAMless cytosine base editor » [ 3 ]. Cette modification permet d’étendre le champ d’application à la presque totalité du génome en reconnaissant plus de séquences. Dans l’étude présentée, les auteurs ont testé cet outil dans les laminopathies et ont montré son efficacité sur des cellules souches pluripotentes issues d’un patient porteur d’une mutation faux-sens dans le gène LMNA . Ils ont réussi à corriger la mutation LMNA c.1366A>G dans l’ensemble des clones générés, aboutissant à une restauration partielle de l’expression des gènes LMNA et S100A6 , un gène co-régulé avec le gène LMNA pendant le développement. Grâce à cette stratégie, les auteurs estiment pouvoir corriger 40 % des mutations faux-sens des dystrophies musculaires liées au gène LMNA .
Top		Liens d’intérêt L’auteure déclare n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.
Top Résumé Liens d’intérêt References		References 1. Wang H , Krause A , Escobar H , et al . LMNA co-regulated gene expression as a suitable readout after precise gene correction. . Int J Mol Sci . 2022; ; 23 : :15525. . 2. Fatehi S , Marks RM , Rok MJ , et al . Advances in CRISPR/Cas9 genome editing for the treatment of muscular dystrophies. . Hum Gene Ther . 2023; ; 34 : :388. – 403.9 . 3. Walton RT , Christie KA , Whittaker MN , et al . Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants. . Science . 2020; ; 368 : :290. – 6 .