Les VE constituent une population très hétérogène de structures membranaires submicroniques, libérées par les cellules de l’organisme. Un travail de nomenclature réalisé par la communauté internationale propose de classer les VE en fonction de leur taille, de leur densité, de leur composition et de leur biogenèse, en distinguant deux sous-types essentiels : les vésicules de petite taille, assimilées aux exosomes et les vésicules plus grandes, regroupant les microvésicules/microparticules et les corps apoptotiques [ 1 ]. Les notions concernant la biogenèse des VE, leur composition et leur rôle biologique sont développées dans d’autres articles de ce numéro thématique.

Une caractéristique commune à toutes les VE est qu’elles sont entourées d’une bicouche lipidique qui en fait de véritables vecteurs capables de transporter des protéines solubles ou membranaires, des lipides, des acides nucléiques, mais aussi des organelles provenant de leur cellule d’origine. Grâce à la puissance des analyses de cytomique, de protéomique, de lipidomique et de génomique, ces différents cargos vectorisés par les VE ont été répertoriés dans des bases de données, telles que EVpedia [ 2 ]. Libérées dans les milieux extracellulaires, les VE ont été identifiées dans de nombreux liquides biologiques de l’organisme, comme le plasma, l’urine, les liquides articulaires, les ascites ou encore le liquide pleural. Ainsi, la composition et l’accessibilité des VE dans ces différents liquides biologiques, les identifient comme des biomarqueurs prometteurs dans les biopsies liquides.

L’émergence du concept de biopsie liquide permet de lever certaines difficultés liées à l’exploration de tissus solides d’accès difficile, comme les vaisseaux, les tumeurs, le cerveau ou le placenta [ 3 – 5 ] ( → ).

(→) Voir les Nouvelles de F. Angelot et al ., m/s n° 1, janvier 2010, page 31, et J. Saint-Pol et F. Gosselet, m/s n° 4, avril 2018, page 303

Une biopsie liquide permet de recueillir des informations sur ces tissus grâce à un prélèvement de liquide biologique en contact avec ces derniers, donnant accès à différents types de biomarqueurs (cellules, protéines et acides nucléiques circulants). Comme illustré Figure 1 , à travers un simple prélèvement de sang, il est possible d’accéder non seulement aux VE produites par les cellules hématopoïétiques, mais aussi à celles produites par les cellules endothéliales ou les tumeurs au contact des vaisseaux. À l’inverse des biopsies solides, les biopsies liquides s’appuient sur des procédures peu invasives, peu coûteuses, apportant des informations utiles pour améliorer le diagnostic, prévenir le risque et suivre l’efficacité de la réponse thérapeutique dans le cadre d’études longitudinales ( Figure 2 ).

Si les VE sont aujourd’hui identifiées comme des biomarqueurs d’intérêt dans ces biopsies liquides, il persiste encore des limitations qui reposent sur les défis techniques liés à l’isolement, la purification et la quantification des VE et de leur contenu, expliquant pourquoi peu d’identifications de cibles vésiculaires ont conduit à ce jour à des applications cliniques. Cela indique que la pertinence clinique des VE en tant que biomarqueur est indissociable de la notion de mesurabilité de la cible ¹ biologique qu’elles vectorisent, grâce à une méthodologie robuste et standardisée, comme cela est rappelé dans la définition officielle d’un biomarqueur selon les NIH ( National Institutes of Health ) américains : « une caractéristique mesurée de façon objective et évaluée comme un indicateur d’une réponse biologique normale ou pathologique ou d’une réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique » [ 6 ].

Lors de leur processus de formation, les vésicules extracellulaires (VE) incorporent une partie des protéines membranaires et cytoplasmiques exprimées par les cellules qui les produisent (dites « parentales »). La détermination de ces cibles protéiques permet d’identifier spécifiquement l’origine cellulaire des VE, d’évaluer les sous-populations de VE présentes dans les milieux biologiques, et d’obtenir des informations sur le niveau d’activation de la cellule parentale. Parmi un large panel de méthodologies existantes pour quantifier ces cibles, la cytométrie en flux (CMF) est la technique la plus utilisée ( Figure 3 ). Fondée sur l’utilisation de sondes fluorescentes spécifiques, la CMF combine les avantages d’une analyse multiparamétrique et quantitative permettant de mesurer les sous-populations de VE avec un bon niveau de spécificité. De plus, il s’agit d’une technique accessible dans de nombreux laboratoires hospitaliers et de recherche. Ces dernières années, la CMF a bénéficié de progrès techniques considérables permettant d’améliorer les capacités de résolution en taille et en fluorescences des cytomètres [ 7 ]. La conséquence en a été une performance accrue pour identifier les VE les moins fréquentes dans la circulation (VE d’origine endothéliale, leucocytaire ou tumorale), mais les plus pertinentes au regard de l’intérêt des biopsies liquides dans certaines circonstances cliniques, comme illustré dans les exemples ci-dessous.

Dans différents contextes à risques cardiovasculaires, des niveaux élevés de VE endothéliales, identifiées par les protéines de surface, comme CD31, CD144 ou CD146, sont corrélés positivement à la dysfonction endothéliale et sont associés à différents facteurs de risques tels que l’obésité, le diabète ou l’hypertension [ 8 ]. Dans une cohorte de 378 patients coronariens, la numération par CMF des VE endothéliales exprimant CD144 est un facteur prédictif indépendant de futurs évènements cardiovasculaires dans les populations à haut risque [ 9 ]. Une autre étude prospective réalisée sur 81 patients dialysés chroniques, suivis durant six ans, a montré qu’une élévation des VE endothéliales CD31 ⁺ /CD41 ^- était prédictive de futurs évènements cardiovasculaires et était associée à un pronostic vital péjoratif [ 10 ]. Dans ces deux populations, illustrant la notion de biopsie liquide endothéliale, l’ajout de la numération des VE endothéliales au score de Framingham ² , améliore la stratification du risque cardiovasculaire.

L’augmentation des VE d’origine leucocytaire est également un biomarqueur du risque cardiovasculaire. Dans une cohorte de 140 patients atteints d’hypercholestérolémie familiale, la mesure de sous-populations de VE leucocytaires, évaluées par CMF grâce à l’analyse de la présence de CD45, une protéine exprimée par les leucocytes, a pu être associée à la survenue d’événements cardiovasculaires et à la survie des patients [ 11 ]. Dans cette étude, l’association de la numération des VE leucocytaires au score de Framingham a permis d’augmenter de façon significative son pouvoir discriminant du risque vasculaire. De plus, l’augmentation des VE leucocytaires quantifiées par CMF dans le plasma grâce à l’analyse de la présence de CD11b et CD66b à leur surface est un biomarqueur indépendant de l’instabilité des plaques d’athérosclérose, illustrant l’intérêt du concept de biopsie liquide chez les patients asymptomatiques présentant une sténose carotidienne pour diagnostiquer le caractère instable de la plaque et orienter le choix thérapeutique [ 12 ].

Dans le domaine du cancer, les VE portent des signatures protéiques (récepteur du facteur de croissance épithélial [EGFR], molécule d’adhérence de l’épithélium [EpCAM], etc.) représentatives des cellules tumorales, permettant de les quantifier dans des biopsies liquides et de les positionner comme potentiels marqueurs diagnostiques, théranostiques ou pronostiques [ 13 , 14 ]. Par exemple, chez des patients atteints de gliome [ 15 ], la quantification du niveau d’expression de l’EGFR sur les VE tumorales, capturées sur microbilles et quantifiées par CMF, est corrélée à la malignité du gliome. Dans une cohorte de 71 patients présentant une pleurésie, la numération par CMF des VE tumorales exprimant EpCAM dans le liquide pleural illustre le fait que ce biomarqueur vésiculaire, accessible dans une biopsie liquide, permet d’améliorer la sensibilité du diagnostic des carcinomes en comparaison à l’utilisation de la cytologie seule [ 16 ].

Les activités biologiques générées par les enzymes actives ou leurs récepteurs exprimés à la membrane des VE sont une source complémentaire de biomarqueurs vésiculaires. En raison de la petite taille des VE, la plupart de ces molécules de surface ne sont pas détectables par les méthodes antigéniques (utilisant des anticorps pour les détecter) alors que leur activité reste accessible grâce à l’amplification du signal de détection par la réaction enzymatique qu’elles engendrent. C’est ainsi que la mise en évidence des propriétés procoagulantes de VE a été à l’origine de leur découverte en 1967 [ 17 ]. Ces propriétés sont dues à la présence, à la surface des VE, de phospholipides anioniques qui vont permettre l’assemblage des enzymes de la coagulation et du facteur tissulaire, principal activateur de la voie exogène de la coagulation. Cette activité procoagulante est quantifiée par des tests fonctionnels mesurant la capacité des VE à générer le facteur Xa ou la fibrine ( Figure 3 ) [ 18 ]. Des développement récents ont permis d’améliorer non seulement la spécificité de ces méthodes, en utilisant des anticorps bloquant le facteur tissulaire [ 19 ], mais aussi leur sensibilité [ 20 ] et leur reproductibilité, notamment grâce à des tests de capture sur billes des VE permettant de s’affranchir des problèmes de reproductibilité liés aux centrifugations habituellement utilisées pour leur purification [ 21 ].

Les études les plus représentatives sont retrouvées dans les thromboses associées aux cancers [ 18 ]. Par exemple, dans une cohorte prospective de 648 patients atteints de cancers solides, l’activité procoagulante des VE, mesurée par un test de génération de fibrine dépendant du facteur tissulaire, s’est révélée significativement augmentée chez les patients subissant un évènement thrombo-embolique dans les six mois de suivi, avec une association à un risque de thrombose quatre fois plus élevée chez les patients atteints d’un cancer du pancréas [ 22 ]. Dans le cadre des complications thrombotiques associées à la Covid-19 ( coronavirus disease 2019 ), une étude réalisée sur une cohorte de 111 patients a montré que l’augmentation de l’activité procoagulante des VE circulantes était associée à la sévérité de la maladie et prédisait de façon indépendante le risque thrombo-embolique [ 23 ]. Outre la prédiction du risque de thrombose associé aux formes sévères de Covid-19, cette activité procoagulante des VE pourrait représenter un biomarqueur vésiculaire permettant de personnaliser les traitements anticoagulants.

La découverte d’ARN dans les VE (VE-ARN) a été une étape clé dans la démonstration de leur rôle dans le transfert intercellulaire de messages génétiquement codés. En plus d’ARN messagers (ARNm), les VE contiennent des ARN non-codants, tels que les micro-ARN (miARN), les longs ARN non-codants (lncARN) et les ARN circulaires (circARN) [ 24 , 25 ] ( → ).

(→) Voir la Nouvelle de S. Manier et al ., m/s n° 11, novembre 2017, page 939

Leur quantification a fait l’objet de recommandations par l’ISEV [ 26 , 27 ] et des outils, comme l’application miRDaR [ 28 ], ont été développés pour sélectionner la méthode d’isolement optimale des VE-ARN en fonction du fluide biologique d’intérêt examiné [ 29 ]. À la suite de cette étape d’isolement des VE, un traitement par la RNase est utilisé pour discriminer entre les ARN présents dans les VE et protégés par la bicouche lipidique de ces dernières, et les ARN extracellulaires non associés aux VE [ 30 ]. Les méthodes de détection des VE-ARN les plus répandues sont la PCR ( polymerase chain reaction ) quantitative en temps réel (RT-qPCR), les puces à ARN ( microarray ), le séquençage de nouvelle génération et le système nCounter ( NanoString Technologies) qui est la technique la plus récente et qui permet la détection d’une seule molécule sans amplification [ 31 ]. Ces différents VE-ARN sont actuellement de plus en plus évalués en tant que biomarqueurs dans une grande variété de maladies, notamment les maladies cardiovasculaires et les cancers [ 32 , 33 ].

Par exemple, dans les maladies cardiovasculaires, la spécificité cardiaque des VE-ARN semble être meilleure que les tests de diagnostic conventionnels reposant sur la troponine myocardique car les miARN sont détectés plus rapidement et sont plus sensibles et spécifiques dans le contexte de l’infarctus du myocarde [ 34 , 35 ]. Les VE-ARN d’origine cardiaque sont détectables dans l’urine, ce qui ouvre la voie à des applications de type biopsie liquide. Par exemple, l’expression significativement élevée du miR-208a, détecté par puce à miARN puis exploré par RT-qPCR dans les vésicules isolées de 50 patients atteints de syndrome coronarien aigu, est une piste très prometteuse pour le diagnostic de cette maladie [ 36 ]. Par ailleurs, différentes études ont mis en évidence le niveau sérique de miR-92b-5p vésiculaire comme biomarqueur potentiel du diagnostic de l’insuffisance cardiaque [ 34 ]. Dans une étude de cas-contrôle menée sur une cohorte de 221 patients atteints de coronaropathie, le taux de lncARN-VE CoroMarker, évalué par RT-qPCR, a été montré comme étant un biomarqueur vésiculaire stable, sensible et spécifique de la maladie des artères coronaires [ 37 ].

Dans les cancers, le test ExoDx Prostate ( IntelliScore ) est le premier test de biopsie liquide à base d’EV, développé par la société Exosome Diagnostics . Chez les patients atteints de cancer de la prostate, cette biopsie liquide urinaire quantifie par RT-qPCR, trois cibles de VE-ARN ( PCA3 [prostate cancer antigen 3] , ERG [erythroblast transformation-specific (ETS) family of transcription factors] et SPDEF [SAM pointed domain-containing Ets transcription factor] ), permettant de discriminer les cancers de haut grade, de bas grade et les tumeurs bénignes [ 38 ]. De même, des miARN appelés oncomiR, comme l’oncomiR-21, ont été identifiés comme des biomarqueurs vésiculaires prometteurs pour le diagnostic et le pronostic de tumeurs solides et hématologiques [ 39 ]. Dans une étude de 195 patients ayant subi une résection curative pour un cancer du poumon, l’expression par des vésicules plasmatiques de miR-21 et de miR-4257 est apparue comme étant un biomarqueur prédictif de récidive [ 40 ].