La technique de centrifugation différentielle permet, étape par étape, de séparer les divers éléments constituant un échantillon selon l’accélération ² ( g ) appliquée, des cellules ou des débris cellulaires jusqu’aux macromolécules, en passant par les vésicules extracellulaires. Pour sédimenter les VE de plus petites tailles, des valeurs de 100 000 à 200 000 x g sont nécessaires. Les protocoles de centrifugation différentielle incluent des étapes progressives de fractionnement des échantillons qui permettent de collecter des culots de matériel biologique tout en préservant les surnageants. Ainsi, à partir d’un milieu complexe, pourront être obtenus des culots à 2K, 10K et 100K correspondant, respectivement, à des centrifugations à 2 000 x g , 10 000 x g et 100 000 x g [ 3 ]. Ce processus global requiert un équipement coûteux et nécessite de longues heures pour le mettre en œuvre dans sa totalité. Il permet, in fine , d’obtenir des fractions enrichies de VE, mais celles-ci ne sont pas pures.

Afin de contourner les limitations majeures de l’ultracentrifugation, des stratégies de précipitation des VE, par réduction de leur solubilité sous l’action de polymères hygroscopiques, ont été développées. Elles permettent d’augmenter les rendements d’enrichissement tout en limitant l’utilisation des ultracentrifugeuses [ 4 ]. Le potentiel de ces techniques, disponibles sous la forme de kits commerciaux, est à relativiser, car la baisse de solubilité induite conduit à la co-précipitation de nombreuses autres entités biologiques, ce qui altère les taux de pureté. Les temps d’incubation restent également très élevés (jusqu’à plusieurs heures selon les kits).

En dépit des différentes limitations évoquées, l’ultracentrifugation et la centrifugation différentielle, de par leur importance comme technique standard en biochimie des protéines, sont encore les techniques les plus communément utilisées pour l’isolement des VE, mais des approches alternatives sont apparues depuis une décennie.

La chromatographie par échange d’ions est la principale technique qui utilise l’état de charge à la surface des VE, apporté par les composants membranaires (les lipides) qui sont chargés négativement. Différents supports anioniques (des billes, des gels, des résines) sont utilisés comme phases solides (ou stationnaires) retenant les vésicules chargées. Après incubation, ou passage à travers une colonne, les VE interagissent avec ces phases solides et s’y lient. Après des étapes de lavage, les VE liées sont éluées par l’action de solutions aqueuses capables de rompre les interactions ioniques établies entre les VE et la phase solide. Si cette technique présente l’avantage de ne pas engendrer de contraintes physiques sur les VE en comparaison avec la filtration ou l’ultracentrifugation, il faut s’assurer que les conditions d’élution (pouvant s’apparenter à un stress chimique) n’impactent pas l’intégrité des structures des VE ni leurs fonctions biochimiques. Enfin une telle approche propose des opportunités de changement d’échelle dans une perspective de bio-production. Elle s’avère en revanche peu sélective des VE dans un milieu biologique très complexe contenant des éléments également chargés, en particulier le sang ou le plasma. Elle est également peu discriminante des diverses sous-populations de VE.

Des avancées récentes ouvrent une voie originale de miniaturisation des techniques de piégeage et de traitement in situ, en particulier les techniques d’électrophorèse appliquées aux VE après leur lyse, afin d’étudier le cargo (macro)moléculaire qu’elles contiennent [ 5 ].

Les techniques décrites précédemment ne proposent pas de stratégies d’isolement en fonction du mode de biogenèse des VE ou de leur origine cellulaire. Il s’agit en effet de méthodes utilisant les caractéristiques physico-chimiques des VE, quelle que soit leur nature. C’est la raison pour laquelle les techniques séparatives fondées sur le principe de la reconnaissance spécifique entre un ligand (naturel ou synthétique) et sa cible biologique, ici une entité macro-biomoléculaire exprimée à la surface des VE, sont parmi les plus utilisées. L’immunoaffinité est largement employée. Elle utilise des anticorps spécifiques qui ciblent avec une très forte sélectivité les protéines membranaires présentes sur les VE. Les principales cibles appartiennent à la superfamille des tétraspanines ³ , en particulier CD9, CD63 et CD81, qui sont enrichies dans les sVE (exosomes et petites microvésicules) [ 6 , 7 ]. L’origine cellulaire des VE peut également être révélée par la présence dans leur membrane de nombreuses protéines issues de la cellule qui les a produites, comme la glycoprotéine EpCAM ( epithelial cell adhesion molecule ) ou des protéines de choc thermique HSP ( heat shock proteins ), ce qui ouvre des perspectives de validation de sous-populations de VE potentiellement indicatrices de maladies [ 8 ].

Dans cette approche, les ligands sélectionnés sont immobilisés sur une phase solide (principalement des billes, des microsphères et autres supports solides), puis incubés en présence de l’échantillon. Les VE interagissant avec ces ligands sont immobilisées, séparées et isolées des autres constituants. L’étape clé conditionnant les phases analytiques concerne la libération des VE immobilisées, opérée par l’utilisation de tampons d’élution ou par compétition (avec l’antigène libre en solution), qui n’offrent pas encore, à ce jour, toutes les garanties sur l’intégrité structurelle et fonctionnelle des VE. Certaines études s’accommodent du support immuno-chromatographique pour analyser le cargo macro-moléculaire qu’elles contiennent, d’autres couplent le dispositif d’immunoaffinité avec un module de bio-détection intégré [ 9 ].

Ces techniques conjuguant rapidité, simplicité et spécificité, offrent des perspectives prometteuses pour des applications cliniques fondées sur l’utilisation de sous-populations de VE [ 10 ]. Les principaux inconvénients résident dans leur coût et la difficulté à utiliser l’éluat pour des études fonctionnelles. L’utilisation de récepteurs synthétiques, tels que les aptamères ⁴ , pourrait permettre de surmonter ces limites.

De très nombreuses techniques séparatives sont donc disponibles pour purifier les VE, chacune d’entre elles présentant des avantages et des inconvénients qu’il est important d’évaluer comparativement [ 11 ]. Une enquête internationale, réalisée auprès de la communauté scientifique travaillant sur les VE, a établi la liste des techniques les plus utilisées ( Figure 1 ) et a permis de mettre en évidence l’utilisation majoritaire de l’ultracentrifugation dans les laboratoires [ 12 ]. À ce jour, il n’existe pas de consensus sur les protocoles d’isolement des VE tant les techniques sont nombreuses et les ressources biologiques variées. Gardiner et al. montre en effet que 59 % des équipes utilisent des approches combinées, dont les protocoles peuvent associer jusqu’à six techniques différentes, pour parvenir, à partir des biofluides les plus complexes à un isolement adapté à leurs investigations. L’objectif d’une standardisation des méthodes pré-analytiques est donc pertinent, en vue de l’utilisation des VE en clinique et, en particulier, pour le diagnostic et le suivi thérapeutique de patients. Cela constitue un défi majeur dans le cadre des études fonctionnelles où la moindre altération de la structure et/ou de la composition des VE peut rendre caduque toute étude.

L’un des moyens les plus simples de caractériser les échantillons biologiques est de déterminer leur composition protéique. Pour les VE, la teneur totale en protéines peut facilement être évaluée à l’aide de dosages colorimétriques (acide bicinchoninique [BCA] ^5, ou Bradford ⁶ ) après purification et extraction. Bien que fréquemment utilisés, ces dosages nécessitent de disposer d’échantillons de VE hautement purifiés, puisque les éventuels contaminants protéiques compromettent évidemment la précision de la mesure. Les méthodes biochimiques les plus couramment utilisées sont des analyses protéiques conventionnelles fondées sur la reconnaissance par des anticorps spécifiques ( immunoblotting assay ) ou des analyses qui reposent sur la capture de VE spécifiques par immuno-affinité ( immunosorbent assay ).

L’ immunoblotting nécessite la lyse préalable des VE purifiées afin de libérer les protéines qu’elles contiennent. L’extrait obtenu sera ensuite analysé soit après dépôt en spot sur une membrane ( dot-blot assay ), soit après séparation des protéines contenues dans l’extrait par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) suivi de leur transfert sur une membrane ( western-blot assay ). Dans les deux cas, les protéines seront ensuite détectées par des anticorps (couplés à une enzyme ou à un fluorochrome) spécifiques de la ou des protéine(s) d’intérêt. L’ immunoblotting est principalement utilisé pour démontrer la présence de protéines connues pour être associées aux VE (CD9, CD63, Alix [ ALG-2-interacting protein X ], Tsg101 [ tumor susceptibility gene 101 ]). Pour les VE isolées à partir de biofluides (urine, plasma, etc.), l’ISEV ( International Society for Extracellular Vesicles ) [ 1 ] recommande néanmoins une quantification supplémentaire des contaminants protéiques couramment co-isolés avec les VE (apolipoprotéines, albumine, etc.) afin d’évaluer leur pureté. Il est à noter que la cytométrie en flux conventionnelle utilise très souvent des billes couvertes d’anticorps pour piéger et ainsi détecter les VE, uniquement via leurs protéines membranaires exposées en surface.

Même si les techniques d’ immunoblotting et d’analyse par cytométrie en flux utilisant des billes sont des méthodes rapides et simples, elles ne sont que semi-quantitatives et présentent les limites d’un essai « en bulk » (c’est-à-dire sur un mélange de vésicules) : en effet, elles ne fournissent pas d’informations sur la teneur en protéines à l’échelle des VE individuelles et ne discriminent donc pas les sous-populations de VE présentes au sein de l’échantillon.

L ’immunosorbent assay . Ce type d’essais, dérivés des tests classiques immuno-enzymatiques (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay ), utilisent des anticorps spécifiques des protéines membranaires des VE. Les vésicules sont généralement capturées sur une surface recouverte d’anticorps ou de mélanges d’anticorps, ciblant ainsi plusieurs sous-populations de VE : la technique @MACSPlex Exosome kit, développée par Miltenyi [ 14 ] propose un kit composé de 37 anticorps différents pour la capture des VE dont les anticorps anti-CD9, anti-CD63 et anti-CD81. Les protéines membranaires d’intérêt présentes à la surface des VE capturées, sont ensuite détectées à l’aide d’anticorps marqués (soit directement, soit indirectement, avec une enzyme) idéalement spécifiques d’un épitope différent de celui reconnu par l’anticorps de capture. L’utilisation d’anticorps de capture et de détection implique que seul un sous-ensemble spécifique de VE, exprimant à leur surface les protéines ciblées, est quantifié et caractérisé [ 1 , 3 ].

Les analyses multiomiques . De nombreuses études cherchant à caractériser les fonctions des VE ou se focalisant sur leur identification comme biomarqueurs, portent sur le profil macromoléculaire à haute résolution de leur contenu (protéines, ARN, lipides), en utilisant des approches de protéomique, de lipidomique, de transcriptomique et de métabolomique. Ces différentes approches de -omiques sont fondamentales pour comprendre la composition, la biogenèse et la fonction des VE. La combinaison de multiples mesures de -omiques permet ainsi d’obtenir une vision beaucoup plus approfondie de la composition et de la fonctionnalité des VE.

Pour identifier ces constituants, par rapport à la technique de LC-MS/MS conventionnelle (chromatographie liquide couplée à de la spectrométrie de masse en tandem), les plates-formes analytiques multidimensionnelles, telles que la spectrométrie de mobilité ionique ( ion mobility spectrometry , IMS)-MS/MS, qui combine chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité ionique et spectrométrie de masse en tandem, offrent des améliorations considérables en termes de résolution, de gamme dynamique (ce qui étend le spectre d’analyse), de nombre d’analytes détectés, et de qualité des spectres de masse obtenus [ 15 , 16 ].

Les méthodes les plus courantes pour la détermination de la taille des VE et leur concentration dans un échantillon utilisent des techniques de lectures optiques ou électriques indirectes.

La nanoparticles tracking analysis . La taille d’une particule détermine la vitesse à laquelle elle diffuse en solution (celle-ci reposant sur le mouvement brownien). Cette relation entre vitesse et taille permet d’estimer le coefficient de diffusion et la taille des VE, observées individuellement, en analysant leurs trajectoires. Cette approche est connue sous le nom de « suivi des particules uniques » (ou SPT) et constitue la base d’une méthode d’analyse très utilisée et appelée nanoparticle tracking analysis (ou NTA).

Cette méthode est fondée sur l’enregistrement par vidéo des mouvements browniens des particules en solution dans un canal ou une chambre microfluidique. Les particules sont révélées par la lumière diffusée (Sc-NTA) ou par la fluorescence émise (Fl-NTA). En analysant un grand nombre de particules, il est possible d’en estimer la concentration et la distribution métrologique, même dans des échantillons polydispersés. Malgré certaines limitations dues notamment à un temps d’acquisition court et à une mesure réduite à un plan focal, la méthode NTA offre une évaluation rapide de la distribution en taille et de la concentration des VE [ 17 ].

La technique tunable resistive pulse sensing (tRPS) détecte et qualifie des nanoparticules individuelles par mesure du changement de courant électrique lors de leur passage à travers un nanopore. L’intensité de la baisse du courant électrique (événement de blocage) peut être reliée au volume de la particule [ 18 ]. En l’absence d’étapes pré-analytiques, cette méthode est relativement difficile à appliquer pour l’analyse des VE en milieux biologiques complexes en raison de la présence d’autres éléments dans le milieu qui peuvent entraîner une obstruction du pore, ou contribuer également au signal enregistré. En plus de mesurer la taille et la concentration des VE, la tRPS peut être utilisée pour des mesures précises de la charge de surface (potentiel zêta) des VE, par la détermination du temps passé par chaque vésicule dans le nanopore en fonction de la pression et de la tension appliquées. Cette fonctionnalité est notamment utilisée dans la conception et l’utilisation des VE pour des applications thérapeutiques potentielles, la charge de surface des VE jouant un rôle important dans leurs propriétés pharmacocinétiques [ 19 ].

La sensibilité et la précision de la tRPS en font une technique d’intérêt pour étudier les solutions de VE purifiées ou enrichies, mais des efforts restent nécessaires pour standardiser les protocoles d’analyse par cette approche.

L’imagerie haute résolution, par microscopie électronique en transmission (TEM et cryoTEM) ou microscopie de force atomique (AFM), permet de déterminer la morphologie et la métrologie des VE avec une résolution nanométrique.

Cependant, la principale limitation de l’utilisation de la microscopie électronique pour des objets biologiques, tels que les VE, réside dans la nécessité d’un vide pour réaliser l’exploration, ce qui impose la fixation et le séchage de l’échantillon. Une telle préparation rend difficile la transposition des structures que l’on observe aux morphologies réelles des objets. Afin d’éviter cette déshydratation de l’échantillon, la technique de cryoTEM est la plus employée pour la caractérisation des VE [ 20 ]. Cette technique repose sur l’imagerie d’un échantillon vitrifié, produit par une congélation flash (à une température inférieure à – 100 °C), d’un film ultrafin d’échantillon de VE. Elle permet une imagerie haute résolution des objets biologiques dans leur état natif. Elle est très utilisée pour déterminer l’ultrastructure des VE. L’immunomarquage des vésicules par des nanoparticules d’or biofonctionnalisées permet en outre d’identifier les sous-populations spécifiques de VE et de les discriminer des autres particules présentes dans un échantillon biologique complexe.

Le faible nombre de VE analysées par la microscopie électronique rend cependant souvent impossible une caractérisation qui soit représentative d’un échantillon complexe et hétérogène. Pour révéler cette hétérogénéité de taille, l’initiative minimal information for studies of extracellular vesicles de l’ISEV [ 1 ] suggère d’analyser un nombre suffisant d’images de grand champ, accompagnées d’images de surface plus réduite, révélant avec une grande résolution les VE individuelles.

La microscopie de force atomique (AFM) se présente comme une alternative aux approches optiques et aux techniques de diffraction électronique pour l’étude des VE. Cette technique utilise une pointe souple et fine qui scanne l’échantillon déposé sur un support, ligne par ligne, en ajustant la distance entre la pointe et les éléments présents, grâce à une boucle de rétrocontrôle. Elle permet de caractériser la topographie de l’échantillon et de relever des informations morphomécaniques ( Figure 2 ) . Les VE peuvent être examinées après avoir été déposées sur un substrat atomiquement plat, ou après avoir été capturées sur un substrat spécifiquement fonctionnalisé par des anticorps, des peptides ou des aptamères, pour caractériser les diverses sous-populations [ 21 , 22 ]. Par sa capacité à quantifier et à sonder simultanément la structure, la biomécanique et le contenu biomoléculaire des VE au sein d’échantillons biologiques complexes, sans besoin de prétraitement, de marquage, ni de déshydratation, l’AFM est désormais de plus en plus employée afin de caractériser les VE de façon fine et multiparamétrique, dans des conditions physiologiques de température et de milieu [ 23 ].

La plupart des développements se concentrent sur la combinaison des principes de l’immuno-marquage et de l’immuno-capture, avec des méthodes physiques avancées de détection des VE. Certaines de ces approches s’intéressent à l’identification de VE individuelle afin d’obtenir le maximum de données fiables à l’échelle du nano-objet. D’autres consistent plutôt à proposer des méthodes globales qui soient abordables et fiables pour une utilisation en clinique.