Vignette (Photo © Inserm-Villoutreix, Bruno).

Même si le coût moyen pour développer un nouveau médicament reste un sujet de controverse avec des évaluations allant de 1,3 à 2,8 milliards de dollars US (soit environ de 1,1 à 2,4 milliards d’euros), il est indéniable que ce coût est non-négligeable quelle que soit l’analyse [ 1 ]. En effet, l’industrie pharmaceutique est une activité à risques avec 90 % des molécules à usage thérapeutique testées chez l’homme qui n’atteignent pas la phase de commercialisation et ceci essentiellement en raison d’un manque d’efficacité ou, dans une moindre mesure, d’un niveau de sécurité suffisant. Afin de remédier à cette attrition lors des phases cliniques, le secteur a mis en œuvre des stratégies visant à augmenter les chances de succès des candidats précliniques. Ainsi, des outils de biologie moléculaire, de génomique et de bio-informatique sont déployés pour optimiser la découverte de cibles pertinentes, et combinés avec des techniques permettant d’améliorer la découverte de candidats telles que la chimio-informatique, la chimie combinatoire ou encore le criblage à haut débit. Le processus de découverte de médicaments s’est ainsi progressivement éloigné de la sérendipité ² du chimiste médicinal, se focalisant principalement sur l’effet biologique d’un composé ou d’une classe de composés pour évoluer vers des approches plus rationalisées et industrialisées dites « cible-centriques » qui permettent d’évaluer l’activité d’un grand nombre de composés directement sur la cible moléculaire d’intérêt. Malgré les énormes avancées scientifiques et techniques réalisées depuis l’avènement de la pharmacologie moderne, le coût considérable de la Recherche et du Développement conduit actuellement la communauté scientifique à s’interroger sur les différentes approches permettant de garantir la mise au point de traitements innovants, abordables et accessibles au plus grand nombre de façon soutenable dans le temps.

Plusieurs analyses ont été menées durant les dix dernières années pour tenter de comprendre la genèse des médicaments innovants depuis 1999, en comparant l’impact des approches dites phénotypiques et celui des approches dites cible-centriques. Une première publication de David C. Swinney et Jason Anthony faisait état, en 2011, parmi les 50 petites molécules approuvées par la FDA ( Food and drug administration ) entre 1999 et 2008 dans une nouvelle classe thérapeutique, de 28 molécules découvertes via des criblages phénotypiques [ 2 ]. Parmi celles-ci, 25 furent découvertes de façon intentionnelle, en s’intéressant spécifiquement à un phénotype défini, et 3 autres par sérendipité en utilisant des tests phénotypiques. Ce chiffre devançant largement le nombre de molécules découvertes par des cribles cible-centriques, les auteurs soulignaient l’intérêt des approches phénotypiques par rapport aux approches cible-centriques mises en avant par l’industrie pharmaceutique durant cette période. Cependant, une seconde étude publiée en 2014 par Jörg Eder, Richard Sedrani et Christian Wiesmann apportait une lecture quelque peu différente, en analysant les approbations de la FDA sur la période de 1999 à 2013 [ 3 ]. En effet, les cinq ans supplémentaires inclus dans cette seconde étude correspondent à un essor majeur des approches cible-centriques suite à l’achèvement du projet de séquençage du génome humain et à l’implémentation de nombreuses techniques de biologie moléculaire en routine dans les processus de Recherche et Développement. Sur les 78 petites molécules approuvées par la FDA dans une nouvelle classe thérapeutique durant cette période, 33 furent découvertes par des approches phénotypiques et 45 par des approches cible-centriques ; pour 9 des 33 molécules découvertes sur la base de tests phénotypiques, le mécanisme d’action est resté mal compris, voire, dans certains cas, complétement inconnu. Ce point souligne le fait que même si la connaissance du mécanisme d’action, incluant l’identité de la cible moléculaire, est un atout, cela ne constitue pas un impératif pour développer avec succès un nouveau médicament. Les auteurs concluaient en mettant en avant l’intérêt des cribles phénotypiques, notamment pour découvrir de nouveaux principes thérapeutiques ou de nouvelles voies moléculaires pour des maladies encore intraitables. Enfin, ils soulignaient le fait que les approches phénotypiques et cible-centriques ne doivent pas être perçues comme étant exclusives, mais plutôt comme complémentaires l’une de l’autre. Ainsi, un objectif majeur pour la recherche serait de rendre les cribles phénotypiques plus performants et efficaces, et de les combiner de façon raisonnée à des stratégies cible-centriques pour aboutir à une démarche globale plus productive. Cette vision rejoint celle décrite par John G. Moffat, Joachim Rudolph et David Bailey qui introduisent, en 2014, la notion d’approche phénotypique définie d’un point de vue mécanistique, et pour lesquels un crible phénotypique est utilisé soit pour optimiser des molécules dont la cible moléculaire est déjà connue, soit pour découvrir des molécules candidates qui seront ensuite caractérisées dans un test moléculaire précis [ 4 ]. L’implémentation de telles approches nécessite la maîtrise d’un ensemble de techniques qui incluent l’utilisation de modèles cellulaires susceptibles de reproduire de façon plus précise la physiopathologie d’une maladie, l’utilisation du criblage à haut contenu permettant d’appréhender la complexité des modèles cellulaires dans le contexte d’une démarche industrielle [ 5 , 6 ] ( → ) et, enfin, les différentes techniques de déconvolution susceptibles d’identifier l’entité et les mécanismes moléculaires dont la modulation provoque l’effet phénotypique souhaité. L’intégration de ces différentes technologies représente une nouvelle donne pour les approches phénotypiques avec pour objectif, l’établissement d’un lien de causalité entre modulation de l’activité ou de l’engagement d’une cible par une entité moléculaire donnée, de ses impacts au niveau cellulaire et de la réponse phénotypique du modèle, permettant ainsi de mieux anticiper l’activité clinique. La Figure 1 résume l’évolution des approches phénotypiques et celles fondées sur la cible dans la recherche de nouveaux médicaments.

(→) Voir la Synthèse de P. Brodin et al ., m/s n° 2, février 2015, page 187

Figure 1. Passé et futur des approches phénotypiques et fondées sur la cible dans la recherche de nouveaux médicaments.

Figure 1. Passé et futur des approches phénotypiques et fondées sur la cible dans la recherche de nouveaux médicaments.

L’approche dite de criblage à haut débit (ou high-throughput screening , HTS) consiste à tester de façon systématique un grand nombre de molécules, le plus souvent chimiques, dans un test in vitro visant à évaluer l’engagement d’une ou plusieurs cibles dont l’activité est supposée être en lien avec une maladie définie. Cette démarche de criblage peut être cible-centrique ou phénotypique, mais dans tous les cas, l’objectif est d’identifier une ou plusieurs entités moléculaires pouvant conduire au développement d’un ou plusieurs candidats médicaments. Depuis la fin des années 1990, le criblage à haut débit s’est enrichi d’approches dites à haut contenu (ou high content screening , HCS). Le HCS vise à extraire à partir d’images, un large ensemble de données quantitatives, spatiales et potentiellement temporelles. Par définition, l’approche HCS est multiparamétrique. Elle vise à évaluer de manière précise un phénomène biologique spécifique [ 7 ] ( → ).

(→) Voir le Dossier technique de R. Prudent et al ., m/s n° 10, octobre 2013, page 897

La précision avec laquelle un phénotype peut être classifié est intrinsèquement liée au nombre de paramètres extraits et au niveau d’information qu’ils véhiculent. Cette spécificité du HCS permet, entre autres, de classer les phénotypes résultant de différents traitements, et d’identifier les faux-positifs lors d’une campagne de criblage [ 8 ]. Les données émanant d’un traitement sont généralement agrégées sur l’ensemble des cellules composant le modèle, dans un souci de simplicité, faisant alors l’hypothèse d’une réponse homogène sur l’ensemble de la population cellulaire. Cependant, la pertinence des modèles biologiques s’accompagnant généralement d’une hétérogénéité des valeurs prises par un même descripteur au sein de la population, il est de plus en plus courant de tenir compte de l’ensemble de ces valeurs au niveau de la cellule unique : on parle alors d’analyse en cellule unique (ou single cell ). Cette hétérogénéité, qui peut provenir de processus comme le cycle des cellules, la différenciation d’une sous-population, ou plus simplement, la proximité spatiale des objets entre eux, peut être à l’origine de variations de la réponse cellulaire. Par exemple, malgré une réponse globale similaire entre plusieurs lignées cancéreuses en termes d’activation de STAT3 par l’interleukin-6 (IL-6), les cellules de chacune de ces lignées ont une réponse différente, avec approximativement 10 % de la population cellulaire qui ne répondent pas au traitement (macro-hétérogénéité), le reste des cellules présentant différents degrés de réponse (micro-hétérogénéité) [ 9 ].

Pour illustrer l’efficacité et la qualité d’un criblage à haut contenu (HCS), une étude réalisée par O’Brien et al . avait comparé les résultats obtenus pour 611 composés en utilisant 7 tests classiques de cytotoxicité et un test HCS [ 10 ] : ce dernier s’est avéré nettement plus sensible (93 %) et spécifique (98 %) que les tests classiques. Ce type de criblage bénéficie des avancées techniques réalisées dans divers domaines, tels que le criblage à haut-débit, l’informatique, la robotique, l’imagerie, l’apprentissage automatique (ou machine learning ) et l’organisation des données (ou data management ). La nature et la précision de la signature phénotypique, extraite par HCS pour un modèle traité par un composé donné, permettent de réaliser des regroupements (ou clustering ) ou des classements de composés (classification). Ceux-ci peuvent être utilisés pour caractériser les molécules au niveau biologique, comme c’est le cas avec leurs signatures physico-chimiques ( Figure 2 ) . La robustesse des marquages, ainsi que la précision des modalités d’acquisition du HCS peuvent alors donner l’occasion d’évaluer avec finesse la similitude entre composés d’un point de vue phénotypique. Les algorithmes d’apprentissage ou d’intelligence artificielle peuvent également bénéficier de ces données multiparamétriques pour inférer l’activité ou la toxicité des composés et ainsi orienter la sélection des molécules actives en sortie de criblage. En combinant ces liens phénotypiques entre molécules et les données historiques, il devient alors possible de conclure in silico quant à l’activité de composés et ainsi orienter le choix des molécules à tester in vitro [ 11 , 12 ].

Figure 2. Les composés chimiques (flèche rouge) issus d’une banque peuvent être caractérisés par leurs structures chimiques (partie basse de la figure) ou de façon indirecte par leurs signatures phénotypiques. Ces signatures sont généralement issues de l’analyse automatisée d’images en microscopie d’un modèle physiologique in vitro . Ces signatures, accompagnées d’une métrique, permettent le regroupement et potentiellement la classification de ces composés.

Figure 2. Les composés chimiques (flèche rouge) issus d’une banque peuvent être caractérisés par leurs structures chimiques (partie basse de la figure) ou de façon indirecte par leurs signatures phénotypiques. Ces signatures sont généralement issues de l’analyse automatisée d’images en microscopie d’un modèle physiologique in vitro . Ces signatures, accompagnées d’une métrique, permettent le regroupement et potentiellement la classification de ces composés.

Les récentes avancées en analyse d’images, rendues possibles grâce à l’utilisation de l’apprentissage profond ( deep learning ) et plus particulièrement d’un type de réseau de neurones artificiels appelé réseau neuronal convolutif (ou convolutional neural network, CNN), permettent d’augmenter la quantité et la qualité des informations extraites, tout en se dédouanant des a priori sur le type de descripteurs à extraire. Ces deux dernières approches peuvent même être combinées et laissent présager des bouleversements majeurs dans la manière de réaliser des cribles en imagerie.

Précisons qu’au-delà des éléments d’analyse que nous avons présentés, l’impact des résultats générés lors d’un crible HCS sur le développement d’un futur médicament est intimement lié à la pertinence physiopathologique du modèle utilisé. Celui-ci doit en effet répondre à un compromis entre sa capacité à être déployé à grande échelle et sa complexité et /ou sa pertinence physiologique, ce qui nécessite une bonne compréhension des processus biologiques sous-jacents.

La combinaison des modèles cellulaires, physiologiquement plus prédictifs, à des approches de HCS représente une réelle opportunité pour la recherche pharmaceutique, même si la cible impliquée dans la modulation du phénotype d’intérêt n’est pas toujours connue. Selon les recommandations de la FDA, l’identification de la cible moléculaire d’un médicament n’est en effet pas nécessaire pour l’initiation des essais cliniques ou l’approbation finale [ 13 ]. Plusieurs exemples montrent en effet que la définition de la cible d’une molécule n’est pas indispensable pour son utilisation, notamment, la cyclosporine, la rapamycine, la rosiglitazone, ou plusieurs classes d’inhibiteurs de canaux calciques, pour lesquels les cibles furent identifiées après leur mise sur le marché [ 14 , 15 ]. Russell A. Miller et al. mettent par exemple en avant le fait que les biguanides, telle que la metformine, connus depuis 1958, sont utilisés de façon sûre et efficace depuis plusieurs dizaines d’années en première ligne pour le traitement du diabète, bien que l’on ne dispose que de très peu d’informations concernant leur cible moléculaire [ 16 ].

La communauté scientifique s’accorde pour faire le constat que les informations relatives à la cible moléculaire, la voie de signalisation impliquée et les mécanismes cellulaires modulés en réponse à un composé, sont autant d’atouts pour mener à bien un programme de découverte de médicaments. Nombreux sont les investigateurs qui considèrent que les actifs issus d’un crible phénotypique sont mieux optimisés par l’utilisation de tests biochimiques. Mais cela suppose de connaître la cible moléculaire du principe actif. En effet, la connaissance de la cible permet d’implémenter des approches de relation structure/activité, guidées par la connaissance de la structure de la cible, qui sont très appréciées des chimistes médicinaux. Ce positionnement résulte très souvent d’un doute sur la qualité statistique des tests phénotypiques ou fonctionnels et, par conséquent, anticipe les difficultés à finement comprendre les impacts structuraux sur l’activité. Néanmoins, même si les tests phénotypiques sont généralement plus difficiles à optimiser et à mettre en place avec un débit suffisant, de nombreux exemples démontrent qu’il est tout à fait possible d’établir des essais aussi robustes opérationnellement et solides statistiquement que des tests biochimiques [ 17 ]. Les tests phénotypiques peuvent ainsi être sensibles aux changements structuraux des composés, comme les tests biochimiques [ 17 ], même si les tests phénotypiques peuvent être soumis à des barrières d’activité, des facteurs comme la perméabilité, le métabolisme ou l’efflux cellulaire, pouvant compromettre l’interprétation de la relation structure/activité qui est observée. La connaissance de la cible moléculaire représente finalement un point de complémentarité entre approches phénotypiques et approches cible-centriques. Les techniques permettant d’identifier la cible impliquée dans la modulation d’un phénotype d’intérêt ( Tableau I ) sont donc clés pour permettre aux approches phénotypiques de délivrer leur plein potentiel. Plusieurs méthodes de déconvolution de cible existent depuis de nombreuses années, mais le regain d’intérêt pour les approches phénotypiques, ainsi que les récentes évolutions techniques élargissent le champ des possibles.

Une des méthodes les plus classiques est la chromatographie d’affinité. Cette approche consiste tout d’abord à modifier chimiquement la molécule d’intérêt afin de pouvoir l’immobiliser sur un support solide (des billes en général). L’extrait protéique contenant la cible est ensuite incubé avec la molécule immobilisée. Après leur élution, les protéines qui s’étaient fixées à la molécule immobilisées sont identifiées par spectrométrie de masse ou immuno-détection (à l’aide d’anticorps spécifiques). Un des avantages de cette technique est qu’elle permet de tester des extraits protéiques natifs et ainsi de conserver la conformation tridimensionnelle originelle des protéines de l’extrait. Cette approche ne peut néanmoins aboutir que si le composé d’intérêt a une affinité suffisante pour la cible dont la modulation est à l’origine de l’impact phénotypique. De plus, pour permettre son identification, la cible doit être suffisamment exprimée dans le modèle cellulaire utilisé à partir duquel sera réalisé l’extrait de protéines. Malgré ces limitations, cette méthode a, par exemple, permis d’identifier la kinase pyridoxal (PDXK) comme cible de la roscovitine (CYC202), un inhibiteur compétitif de l’ATP, dans différents tissus et cellules, et cela en plus de ses autres cibles déjà connues (ERK[ extracellular signal regulated kinase ]1/2, et CDK[ cyclin-dependent kinase ]2,5) [ 18 ]. Cette molécule est actuellement en essai clinique de phase II pour le traitement de la mucoviscidose.

L’évolution technologique du criblage à haut contenu combinée aux importants progrès réalisés dans des domaines aussi variés que les modèles cellulaires in vitro et les stratégies de déconvolution de cibles, sont à l’origine d’un fort regain d’intérêt pour les approches phénotypiques dans le contexte de la recherche de nouveaux candidats médicaments. La combinaison de ces diverses techniques permet désormais d’appréhender la découverte de médicaments de façon plus intégrée d’un point de vue mécanistique en déployant les approches phénotypiques pour optimiser des molécules dont la cible moléculaire est déjà connue, ou pour découvrir des molécules candidates qui seront ensuite caractérisées dans un test moléculaire précis. Il ne fait, par ailleurs, aucun doute que les évolutions actuelles dans le domaine de l’intelligence artificielle vont amplifier cette tendance et que nous ne sommes qu’à l’aube d’une nouvelle donne pour les approches phénotypiques.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.