Sémaphorines et plexines Les NRP ont été décrites initialement comme des récepteurs neuronaux liant les sémaphorines (SEMA), une famille de protéines (sept classes ont été décrites) dont le rôle est de guider la croissance des axones. Les NRP, via leurs domaines a1, a2, b1 et b2, interagissent avec les plexines, les récepteurs spécifiques des SEMA [8]. C’est cette liaison qui conduit à l’activation des voies de signalisation impliquées dans le développement, le guidage axonal et dans l’immunité. NRP1 se lie préférentiellement à SEMA3A et NRP2 à SEMA3C ou SEMA 3F [8].

VEGF et VEGFR Le gène VEGF (vascular endothelial growth factor) comprend 8 exons. Les exons 1 à 5 correspondent à des domaines de la protéine impliqués dans la liaison à ses récepteurs (les VEGFR1 et VEGFR2) tandis que les domaines codés par les exons 7 et 8 se lient à NRP1 et NRP2. Les différents épissages des exons 6, 7 et 8 du gène génèrent deux familles distinctes d’isoformes de la protéine. Les isoformes correspondant à l’exon 8a sont pro-angiogéniques tandis que les isoformes provenant de l’exon 8b sont anti-angiogéniques [9]. Quatre formes prédominantes de VEGF existent : le VEGF121, le VEGF189, le VEGF206 et, surtout, le VEGF165 qui est le plus abondant et le plus actif dans de nombreux cancers. Il se lie préférentiellement à NRP1 (avec un Kd de 0,2nM) plutôt qu’à NRP2 (pour lequel le Kd est de 5nM).

La liaison du VEGF165 à NRP1 conduit à la formation d’un complexe associant les récepteurs VEGFR1 et VEGFR2. Cette association entre les VEGFR et NRP1 amplifie le signal induit par le VEGF165 et stimule ainsi l’angiogenèse. NRP2 lie le VEGF165 et le VEGFC, le principal facteur de lymphangiogenèse. Il s’associe aux récepteurs VEGFR2 et VEGFR3 pour stimuler l’angiogenèse et la lymphangiogenèse. La liaison entre ces VEGFR et NRP2 repose sur les domaines b1 et b2 de la protéine NRP. Les VEGFR peuvent également être activés par les VEGF, indépendamment des NRP. La liaison du VEGF à NRP1 induit la migration cellulaire et stimule l’angiogenèse sans intervention des VEGFR. À noter que les NRP solubles (sNRP) sont des compétiteurs pour la liaison du VEGF au NRP1 membranaire.

Une surexpression des VEGF a été observée dans la plupart des cancers humains. L’étude de la stimulation des NRP par le VEGF semble donc pertinente dans un contexte thérapeutique.

HGF et cMET La signalisation induite par la fixation du facteur de croissance hépatocytaire (HGF) à son récepteur (cMET) régule la survie, la prolifération et la migration des cellules endothéliales. La liaison de HGF à cMET joue également un rôle important dans la progression tumorale. En s’associant à cMET, NRP1 amplifie l’invasion tumorale induite par HGF. La liaison d’HGF à cMET inhibe l’apoptose et favorise la tolérance immunitaire, en interagissant avec le ligand de mort programmé 1 (PD-L1) [10]. NRP1 stimulerait ainsi la croissance tumorale en inhibant l’immunité antitumorale.

TGF-b1 et TGF-bR La fixation du TGFβ1 (transforming growth factor beta 1) à son récepteur, le TGFβR, stimule la voie de signalisation impliquant SMAD2 et SMAD3, régule la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et promeut la progression et l’invasion tumorale. NRP1 fixe le TGFβ par son domaine b1 et interagit avec les récepteurs TGFβR1, 2 et 3. La signalisation qui en résulte stimule l’angiogenèse indépendamment du VEGFR2. Le complexe TGFb/NRP1/TGFbR promeut également l’activité des lymphocytes T régulateurs et donc la tolérance immunitaire.

PDGF et PDGFR La liaison du PDGF (platelet-derived growth factor) à son récepteur (le PDGFR) induit une signalisation qui stimule la prolifération et la différenciation cellulaires. Il existe quatre formes de PDGF : PDGFA, B, C et D, qui s’homo- ou s’hétéro-dimérisent et se fixent sur les récepteurs PDGFRα ou β, des récepteurs tyrosine kinase qui s’autophosphorylent après liaison de leur ligand. Selon l’isoforme de PDGF, le récepteur s’homo- ou s’hétéro-dimérise, conduisant à trois combinaisons entre les deux formes du récepteur : αα, αβ ou ββ. La liaison du PDGF au PDGFR active les MAPK (mitogen-activated protein kinases) et la voie impliquant la phosphoinositide 3-kinase (PI3K). NRP1 s’associe au PDGFR lié au PDGF, amplifiant ainsi les voies de signalisation qui sont induites.

FGF et FGFR2 La fixation du FGF (fibroblast growth factor) au récepteur FGFR2 induit la migration et la prolifération cellulaires. Cet axe de signalisation est majeur pour la prolifération des cellules endothéliales et donc pour l’angiogenèse. En s’associant au FGFR2, les NRP jouent un rôle clé dans l’amplification des signaux qui sont induits par le FGF.

La voie de signalisation Hedgehog La voie de signalisation Hedgehog est impliquée dans l’embryogenèse et, chez l’adulte, dans la réparation tissulaire. Son activation stimule la prolifération et la différenciation cellulaires. Sa sur- ou sous-expression est à l’origine du développement de cancers. Dans des cellules de cancers du rein à cellules claires (ccRCC), la réduction de l’expression de NRP1 (par shARN^4,) permet de diminuer celle de sonic hedgehog (SHH)⁵ et de son activateur transcriptionnel Gli1 (glioma-associated oncogene homolog 1). L’inhibition de la voie de signalisation impliquant SHH force la différenciation des cellules tumorales [11].

Les cellules dendritiques Ces cellules sont recrutées au site où un antigène est présent. En réponse, elles subissent une maturation qui leur permet de migrer vers les organes lymphoïdes afin d’activer les lymphocytes T naïfs et induire la réponse immunitaire primaire spécifique de l’antigène. NRP1, qui est exprimé par les cellules dendritiques matures et par les lymphocytes T naïfs, permet l’adhérence des deux cellules par une interaction homophilique (NRP1/NRP1). NRP1 participe donc à l’activation de la réponse immunitaire primaire. NRP1, exprimé à la surface des lymphocytes T, peut également interagir avec SEMA3A qui est présent sur les cellules dendritiques et les lymphocytes T, ce qui inhibe l’activation et la prolifération de ces derniers et donc induit une tolérance immunitaire [12].

Les cellules dendritiques peuvent avoir pour origine les monocytes circulants. La différenciation de ces monocytes en cellules dendritiques s’accompagne d’une augmentation d’expression de NRP2 [13]. La sialylation de NRP2 protègerait en fait les cellules dendritiques lors de leur migration vers les ganglions lymphatiques. Dans les ganglions, l’acide polysialique porté par NRP2 sera éliminé, permettant aux cellules dendritiques d’activer les lymphocytes T [14].

Les macrophages Les macrophages jouent un rôle prépondérant dans la surveillance immunitaire, l’élimination des débris cellulaires et la présentation antigénique aux lymphocytes. Deux types de macrophages ont été distingués : les macrophages de type M1 qui sont pro-inflammatoires et les macrophages de type M2, pro-angiogéniques, immunosuppressifs et donc pro-tumoraux, notamment dans les tissus qui sont hypoxiques. L’hypoxie induit l’expression de SEMA3A par les cellules tumorales. Elles peuvent alors interagir avec NRP1 qui est exprimé par les macrophages, en association avec les récepteurs de SEMA3A, les plexines A1 et A4, également exprimés par les macrophages. Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) sont retenus dans les zones hypoxiques où ils exercent leur rôle pro-tumoral. La diminution de l’expression de NRP1 par les macrophages se traduit par une limitation de la localisation de ces TAM dans les zones périphériques de la tumeur qui sont normoxiques, ce qui supprime le caractère pro-tumoral de ces cellules [15]. Dans la microglie (constituée de cellules macrophagiques au niveau du cerveau), NRP1 joue un rôle immunosuppresseur en favorisant la différenciation des cellules vers un phénotype de type M2. Une interaction homophilique (NRP1/NRP1) entre cellules microgliales et lymphocytes T régulateurs provoque une libération de TGF-β et une immunosuppression. L’expression de NRP1 par les macrophages associés aux gliomes (GAM) provoque ainsi une réponse pro-tumorale. Son inhibition réduit la croissance tumorale et induit une polarisation des cellules vers le type M1, antitumoral [16].

L’expression de NRP2 augmente lors de la différenciation des monocytes en macrophages [13] à proximité des zones d’inflammation, ce qui se traduit par une augmentation de la capacité de phagocytose des cellules. À noter que la sialylation de NRP2 réduit la capacité de phagocytose des macrophages [17].

Les lymphocytes T Les lymphocytes T cytotoxiques (T CD8⁺) détruisent les cellules infectées présentant un peptide antigénique issu du pathogène associé à une molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I. L’expression de NRP1 est augmentée à la surface des lymphocytes T CD8⁺ effecteurs et mémoires, et favorise la reconnaissance de l’antigène [8]. Néanmoins, le rôle exact de NRP1 dans ce contexte reste inconnu.

Les lymphocytes T auxiliaires (T CD4⁺) produisent de l’interleukine 2 et de l’interféron gamma qui stimulent la prolifération des lymphocytes T et B. NRP1 est exprimé par les lymphocytes T CD4⁺. Il permet, par ailleurs, la maturation des lymphocytes B [8].

Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont essentiels à la prévention des maladies auto-immunes. NRP1 maintient ces fonctions grâce à son interaction avec SEMA4A, exprimée par les cellules dendritiques. Cette liaison stabilise en effet les lymphocytes Treg en recrutant PTEN (homologue de phosphatase et tensine) et en inhibant la phosphorylation d’Akt. L’expression de NRP1 par les lymphocytes Treg permet leur migration vers les tumeurs où ils jouent un rôle immunosuppresseur. La liaison homophilique des molécules NRP1 exprimées par les cellules dendritiques induit une tolérance immunitaire [8].

L’expression de NRP2 est amplifiée dans les lymphocytes T CD4⁺/CD8⁺ mais elle est moins importante sur les lymphocytes T qui n’expriment que CD8 ou que CD4. L’interaction entre NRP2, SEMA3F et la plexine A1, inhibe la migration des lymphocytes T immatures.

Les cellules NKT (natural killer T) représentent un lien entre immunité innée et immunité adaptative. Activées, elles sont capables de détruire leur cible cellulaire et produisent des cytokines anti- et pro-inflammatoires. Le rôle de NRP1 exprimé par ces cellules reste inconnu [8].

Les NRP ont donc différents rôles dans le système immunitaire. Ils interviennent dans les capacités de migration des cellules, dans leur interaction avec d’autres cellules mais aussi dans la régulation de leur réponse immunitaire.

Peptido-mimétiques glycosylés Des peptido-mimétiques dérivés d’A7R et rigidifiés à l’aide d’un motif carbohydrate remplaçant la séquence LPRR ont été développés [30] (Figure 2B). Le peptido-mimétique le plus puissant intègre un motif phénylsulfonamide et une arginine. Il inhibe l’interaction du VEGF avec NRP1, et altère la tubulogenèse. Sa stabilité au sein du site de fixation du VEGF dans NRP1 repose non seulement sur un réseau dense de liaisons hydrogène, impliquant en particulier son motif guanidinium et l’Asp-320 de NRP1, mais également une interaction p - p ⁶ ou cation- p impliquant son noyau phénylsulfonamide.

Pentapeptides rigidifiés Des pseudo-peptides ramifiés de séquence générale Lys(hArg)-AA²-AA³-Arg^7, ont également été réalisés [31]. Les premières structures décrites possédaient une proline en position AA³. L’interaction entre ces pseudo-peptides et NRP1 repose sur des liaisons hydrogène établies entre la partie Lys(hArg) du peptide et le carboxylate de l’Asp-320 de la protéine. La partie centrale de la séquence, les résidus AA² et AA³, interviennent également dans la liaison. Différentes optimisations ont été réalisées, en remplaçant la proline en position AA³ par certains de ses isostères^8, conventionnels (Figure 2C). Sa substitution par la 3,4-déhydroproline (ΔPro) ou par l’octahydroindole (Oic) induit une stabilité métabolique du peptide qui augmente son affinité pour NRP1. Ces molécules sont en cours de développement. Des petits peptides cycliques dérivés d’A7R, plus résistants in vivo que les peptides linéaires, ont également été synthétisés [31].

Identification du composé ChemBridge ID : 7739526, non testé in vivo Les dockings (ou arrimages moléculaires)^10, modélisés à partir de la structure cristallographique obtenue par interaction de NRP1 avec la tuftsine (code PDB : 2ORZ)¹¹ ont permis aux équipes de B. Villoutreix et G. Perret (Lille) d’identifier 508 molécules potentiellement capables d’interagir avec NRP1. Leur capacité d’inhibition de la liaison entre le VEGF165 et NRP1 a été examinée (à une concentration de 100 µM) faisant émerger 7 hits (inhibition supérieure à 40 %). Une nouvelle étape de crible in silico, destinée à identifier de nouveaux produits présentant des similarités structurales avec les 7 hits initiaux, a été réalisée, révélant de nouveaux candidats qui ont également été testés pour leur pouvoir inhibiteur. Ce processus a été répété une troisième fois. Le meilleur composé obtenu par cette approche (ChemBridge ID : 7739526) présente une capacité d’inhibition de la liaison du VEGF165 à NRP1 comparable à celle de la tuftsine [36]. Cette molécule ne contient pas de fonction guanidinium. La prédiction de liaison suggère que l’hydrogène du motif hydroxyle de la molécule établit une liaison hydrogène avec l’Asp-320 de NRP1 et que la Glu-348 de la protéine établit une liaison hydrogène avec l’oxygène de la fonction éther reliant les deux noyaux aromatiques. Les effets de ces composés sur les cellules n’ont pas été examinés.

NRPa-47 et NRPa-308, deux antagonistes non peptidiques de NRP1 actifs in vivo Dans ce crible multi-étapes réalisé par les équipes de C. Garbay, M. Montes et O. Hermine (Paris), le crible virtuel a été réalisé en utilisant pour modèle le co-cristal NRP1/tuftsine et les logiciels Surflex-dock et ICM-VLS, pour la modélisation. Une liste consensus de 3 000 composés-candidats, des petites molécules dépourvues de motifs peptidiques a émergé. L’analyse de leurs dockings avec NRP1 a permis de retenir 1 317 molécules qui ont été testées in vitro. Les tests fonctionnels réalisés sur des cellules endothéliales (crible cellulaire) ont réduit la liste à 158 candidats puis 56 molécules ont été retenues pour leur capacité à inhiber l’interaction entre le VEGF165 et NRP1 lors d’une étape de crible moléculaire. La détermination sur des cellules humaines de cancer mammaire (MDA-MB-231) des concentrations inhibitrices (IC₅₀) de ces 56 composés, a permis d’identifier deux molécules, NRPa-47 et NRPa-308, comme étant les plus prometteuses [37-39]. Ces deux candidats présentent des IC₅₀ sub-micromolaires sur des cellules endothéliales et de cancer du sein (Figure 4).

Le NRPa-47 présente un noyau benzimidazole connecté à un noyau benzodioxane par un bras espaceur carboxythiourée. Cette molécule est dépourvue de motif guanidinium, et l’atome d’azote du benzimidazole interagit avec l’Asp-320 de NRP1 via une liaison hydrogène. Le soufre du bras espaceur et l’un des atomes d’oxygène du benzodioxane établissent des liaisons hydrogène avec les résidus de la poche de liaison de NRP1 (Tyr-297 pour le soufre ; Tyr-353 et Thr-349 pour l’oxygène). Ce docking a permis d’optimiser la structure de cet antagoniste et d’identifier ainsi le NRPa-48 comme étant un nouvel inhibiteur de NRP1. Ce dernier composé présente des activités antiprolifératives comparables à celles du produit parent.

Le NRPa-308 possède trois noyaux aromatiques. La prédiction par docking suggère que le noyau portant l’éther d’éthyle s’insère profondément dans la poche de fixation de l’arginine, et interagit par p-stacking ¹² et/ou interactions hydrophobes avec les noyaux aromatiques des Tyr-297 et Tyr-353. Cette prédiction suggère que l’oxygène de l’amide et l’azote du sulfonamide du NRPa-308 établissent des liaisons hydrogène avec le Trp-301 et la Glu-348 de NRP1.

Sur des lignées de carcinome du rein à cellules claires, le NRPa-308 exerce des effets antiprolifératifs marqués. Il est moins toxique pour des cellules isolées de tissus sains que le traitement de référence de ces cancers, le sunitinib : il possède donc un indice de sélectivité supérieur à celui du sunitinib.

NRPa-47, NRPa-48 et NRPa-308 exercent une activité anti-angiogénique et réduisent la mobilité des cellules endothéliales. Ils sont cytotoxiques sur plusieurs lignées cellulaires cancéreuses résistantes. NRPa-47 et NRPa-308 ralentissent la croissance de tumeurs expérimentales du sein chez la souris, prolongent la survie des animaux et retardent la formation de métastases. Ces molécules réduisent la vascularisation des tumeurs sans induire de toxicité aiguë. Des résultats récents suggèrent que le NRPa-308 est internalisé par les cellules tumorales [39]. Le mécanisme du franchissement de la membrane cellulaire n’est cependant pas élucidé, mais il pourrait dépendre de l’activité de transporteur des NRP.