Vignette (Photo © Franck Aguila).

La découverte des gènes Ras remonte au début des années 1960 quand Jennifer Harvey (London Hospital Research Laboratories, Londres, Royaume-Uni), alors qu’elle tentait d’infecter des rats avec un virus leucémogène chez la souris, le virus de Moloney, observe que les rats infectés développent, en plus de l’érythroleucémie attendue, des tumeurs solides, sous forme de sarcomes anaplasiques, près du site d’inoculation. Des extraits filtrés dérivés de ces tumeurs reproduisaient cette pathologie de leucémie et sarcome quand ils étaient injectés à des souris et des rats. Le premier virus sarcomatogène de mammifères (Ha-MSV) venait d’être isolé [1]. En 1967, suivant une stratégie similaire, le virus sarcomatogène (Ki-MSV) était généré lors de l’infection de rats par le virus leucémogène de la souche Kirsten (Ki-MuLV) [2]. Mais quels éléments viraux étaient responsables de ces propriétés tumorigènes d’un virus leucémogène, lors de l’infection d’un rat ? Il fallut attendre 1981 et le séquençage des génomes des virus Ha-MSV et Ki-MSV [3] pour caractériser les séquences génomiques de rat capturées par ces virus. Ces séquences responsables de l’activité sarcomatogène de Ha-MSV et Ki-MSV furent appelées Ras (pour rat sarcoma). Elles étaient conservées évolutivement et, notoirement, il apparut qu’il existait des homologues cellulaires chez l’homme. Ces deux premiers gènes Ras (v-H-Ras et v-K-Ras) transduits par des rétrovirus murins codaient une protéine de 21 kDa (p21). Une protéine p21 responsable de l’activité oncogénique des virus Ha-MSV et Ki-MSV avait par ailleurs été identifiée dès 1979, dans des cellules infectées par des mutants thermosensibles de ces deux virus [4].

À cette époque, une question centrale posée dans la recherche sur le cancer était celle de l’étiologie des tumeurs humaines qui n’étaient pas provoquées par des virus. Un pas décisif fut franchi par l’observation qu’un ADN exogène extrait de carcinomes de vessie et transfecté dans des cellules de souris NIH-3T3 provoquait leur transformation morphologique. Elle permit l’identification par quatre équipes indépendantes (R. Weinberg, Massachusetts Institute of Technology [MIT] ; M. Wigler, Cold Spring Harbor Laboratory, New York ; G. Cooper, Harvard Medical School, Boston ; M. Barbacid, National Institutes of Health [NIH], Bethesda) du premier oncogène humain, qui se révéla être un variant activé du gène humain c-H-RAS [5-8]. La différence entre séquence du gène oncogénique et séquence du gène normal correspondant était subtile : le potentiel oncogénique de Ras était simplement dû à une mutation ponctuelle dans le codon 12 du gène, changeant un acide aminé glycine en valine dans la séquence de la protéine p21.

L’utilisation extensive de cette stratégie de transfection d’ADN dans les cellules NIH-3T3 pour rechercher des gènes dotés d’un potentiel oncogénique dans des tumeurs d’origines différentes (poumon, côlon, pancréas, vessie, sein, ovaire, lymphomes, leucémies myéloïdes) mit ensuite en lumière le fait que beaucoup des gènes transformants étaient des homologues de c-H-Ras et c-K-Ras. La découverte du troisième gène RAS est ainsi issue de la transfection de l’ADN d’une lignée de neuroblastome humain dans les cellules NIH-3T3 [9]. Dénommé N-RAS, ce gène s’avèra être très similaire à H-RAS et K-RAS et être fréquemment activé dans les tumeurs humaines, avec une certaine spécificité pour les tumeurs d’origine hématopoïétique.

In fine, l’analyse de la séquence du gène N-RAS comme de celle des gènes H-RAS et K-RAS dans les différentes tumeurs, montre que l’activation du potentiel oncogène du gène Ras est due à des mutations ponctuelles ciblant alternativement deux domaines de la protéine p21, au niveau des acides aminés en position 11,12 et 13 ou 59 et 61.

La fonction biochimique des protéines p21ras a été ensuite rapidement décryptée [10]. Ce sont des GTPases de petit poids moléculaire (20-25 kDa), capables de lier les nucléotides GTP et GDP, et possédant une activité GTPase intrinsèque d’hydrolyse du GTP. Elles sont impliquées dans la transmission des signaux générés par l’interaction d’un facteur de croissance avec son récepteur exprimé à la surface de la cellule, affectant les processus intracellulaires en aval du récepteur. Les mutations ponctuelles dans les domaines de liaison au GDP/GTP conduisent à un dysfonctionnement de ces protéines en les bloquant sous leur forme activée liée au GTP, ce qui est à l’origine de leur activité oncogénique.

En séquençant la région génomique localisée en amont du gène codant l’actine de la levure Saccharomyces cerevisiae, l’équipe de Dieter Gallwitz (Max-Planck Institute for Biological Chemistry, Göttingen) identifie en 1983 un gène homologue de Ras qu’ils nomment YPT1 [11]. YPT1 sera le premier membre de la future famille Rab (voir ci-dessous). Peu de temps après, Pascal Madaule, jeune post-doctorant français dans l’équipe de Richard Axel (Columbia University, New-York) à la recherche des gènes codant des peptides neurotropes chez l’aplysie (un mollusque gastéropode marin à corps nu, appelé également lièvre de mer) clone un autre gène homologue de Ras qui s’avèrera être le membre fondateur de la famille Rho (voir plus loin) [12].

S’appuyant sur l’existence des deux isoformes du gène Ras et la découverte des deux homologues de Ras chez la levure et l’aplysie, Pierre Chardin, alors étudiant en thèse dans l’unité Inserm U248 dirigée par Armand Tavitian à la Faculté de médecine Lariboisière Saint-Louis (Paris), émet l’hypothèse que les gènes Ras constituent en fait une vaste famille, codant une variété de protéines. Pour valider cette hypothèse, il met au point une méthode originale fondée sur l’identification d’une région peptidique minimale conservée entre les différentes protéines Ras et nécessaire à leur activité d’hydrolyse du GTP (la séquence d’acides aminés « DTAGQE »). Il dessine et synthétise (manuellement à cette époque !) un oligonucléotide dégénéré codant ce peptide qu’il utilise pour cribler, dans des conditions d’hybridation à faible stringence, des banques d’expression du génome humain, afin de rechercher les séquences correspondant à de nouveaux gènes Ras. Son premier essai l’amène à identifier un gène humain qu’il nommera RAL (pour RAS-like) [13]. Il existe en fait deux gènes paralogues chez l’homme, RALA et RALB, qui codent des protéines présentant 83 % d’identité entre elles. On sait aujourd’hui que les protéines Ral et leurs effecteurs jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions cellulaires (Figure 1). Elles sont elles-mêmes par ailleurs des effecteurs des protéines Ras et semblent nécessaires à leur action oncogénique (Figure 1).

Figure 1. Les 5 grandes familles de la superfamille Ras : A. Ras, Ral. B. Rap, Rho, Rab. Les protéines cyclent entre une forme inactive liée au GDP, et une forme active liée au GTP. Ces transitions sont régulées par des GEF activatrices stimulant l’échange du GDP par le GTP, et des GAP qui stimulent leur activité GTPase et les ramènent à leur état inactif. Dans le cas des protéines Rho et Rab, des protéines appelées GDI (GDP displacement inhibitor) participent également au cycle GDP/GTP en les maintenant inactives dans le cytosol. PI3K : phosphoinositide 3-kinase.

Figure 1. Les 5 grandes familles de la superfamille Ras : A. Ras, Ral. B. Rap, Rho, Rab. Les protéines cyclent entre une forme inactive liée au GDP, et une forme active liée au GTP. Ces transitions sont régulées par des GEF activatrices stimulant l’échange du GDP par le GTP, et des GAP qui stimulent leur activité GTPase et les ramènent à leur état inactif. Dans le cas des protéines Rho et Rab, des protéines appelées GDI (GDP displacement inhibitor) participent également au cycle GDP/GTP en les maintenant inactives dans le cytosol. PI3K : phosphoinositide 3-kinase.

Les cribles suivants se révèlent tout aussi fructueux. Pierre et ses collègues du laboratoire (Nicolas Touchot, Ahmed Zahraoui, Véronique Pizon, Isabelle Lerosey et d’autres) identifient ainsi les premiers gènes Rab (pour Ras-like in rat brain) [14, 15]. Les protéines Rab constituent la branche la plus étendue de la superfamille Ras (plus de 70 membres ont été identifiés à ce jour chez l’homme). Localisées sur la membrane de tous les compartiments de la cellule, ce sont des régulateurs essentiels du transport intracellulaire. En interagissant avec une grande variété d’effecteurs (moteurs moléculaires, kinases et phosphatases, protéines d’échafaudage, etc.), elles régulent toutes les étapes du transport vésiculaire, depuis la formation des vésicules de transport, leur mouvement le long du cytosquelette et leur ciblage vers leur destination finale. Les protéines Rab contribuent aussi à spécifier l’identité structurale et fonctionnelle des compartiments de la cellule [16] (Figure 1).

Ils identifient aussi les premiers gènes Rap (pour Ras proximal) [17]. Les cellules de mammifères expriment deux protéines Rap1 (Rap1A et Rap1B) et trois protéines Rap2 (Rap2A, 2B et 2C). Ces protéines sont impliquées dans de nombreuses cascades de signalisation régulant l’adhérence cellulaire dépendant des intégrines, l’assemblage des contacts intercellulaires, l’établissement de la polarité, l’exocytose ou la prolifération cellulaire [18] (Figure 1).

Un peu plus tard, Pierre Chardin s’intéressera aussi aux protéines de la famille Rho et caractérisera notamment la protéine Rnd1 (appelée aussi Rho6) [19]. La famille Rho (Rho, Rac, Cdc42, Rnd) compte une vingtaine de membres impliqués essentiellement dans la dynamique du cytosquelette d’actine (polymérisation de l’actine, nucléation et extension des filaments, etc.) (Figure 1) [20]. Elles induisent ainsi plusieurs types d’organisation de l’actine qui sont à l’origine de nombreux processus cellulaires (mise en place de la polarité, migration, croissance axonale, etc.).

Après leur identification, la question du fonctionnement des protéines Ras et apparentées est très vite posée. Elle sera élucidée par la découverte de deux autres grandes familles de protéines qui régulent leur activité : les GEF (guanine nucleotide exchange factors) et les GAP (GTPase-activating proteins) (Figure 1). L’affinité des protéines de la superfamille Ras pour le GDP et le GTP est très forte (de l’ordre du nM) et, de surcroît, la concentration du GTP est seulement environ 10 fois plus élevée que celle du GDP dans les cellules, rendant l’échange « spontané » du GDP pour le GTP relativement inefficace. Les GEF agissent en stabilisant une forme sans nucléotide des protéines Ras et apparentées, ce qui favorise l’échange du GDP pour le GTP et donc l’activation des GTPases. Leur activité intrinsèque d’hydrolyse du GTP est par ailleurs très faible ; les protéines GAP stimulent fortement cette activité d’hydrolyse, permettant aux GTPases de revenir rapidement (dans des échelles de temps compatibles avec les processus biologiques qu’elles contrôlent) sous une forme inactive liée au GDP.

Pierre Chardin sera de cette aventure là aussi et souvent pionnier dans un contexte de compétition internationale très rude. Il caractérisera notamment le premier facteur d’échange de la protéine Ras chez l’homme, hSos1 (l’homologue humain de la protéine de drosophile son of sevenless) [21], et participera à la mise au point d’une méthode originale permettant de mesurer l’activité d’hydrolyse de Ras stimulée par RasGAP [22].

Quarante ans après la caractérisation de la première protéine Ras, les GTPases de la superfamille Ras occupent une place centrale dans la physiologie de la cellule. Alternant entre une forme liée au GDP et une forme liée au GTP, elles agissent comme des interrupteurs moléculaires permettant de réguler dans l’espace et le temps la plupart des fonctions cellulaires sinon toutes. Il n’est donc pas étonnant que des altérations de leur cycle et de leur(s) fonction(s) soient responsables de très nombreuses maladies, et en premier lieu de cancers. Un des enjeux majeurs pour le futur est de capitaliser l’énorme masse de connaissances fondamentales accumulées pour concevoir des inhibiteurs spécifiques et développer de nouvelles approches de thérapies ciblées.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.