La myopathie de Bethlem est une myopathie rétractile avec une faiblesse musculaire d’intensité variable et de topographie principalement proximale. Les rétractions sont très souvent au premier plan et précèdent fréquemment le déficit musculaire. Transmise sur le mode autosomique dominant ou récessif, la myopathie de Bethlem est désormais classée parmi les dystrophies musculaires des ceintures (LGMD D5 et R22 selon le mode d’hérédité) [1]. Les symptômes s’aggravent au cours de la vie avec une perte musculaire proximale progressive, un risque accru d’insuffisance respiratoire et une mobilité réduite [2, 3]. Cette myopathie résulte de mutations dans un des gènes codant l’une des trois chaînes α du collagène VI (COLVI), un composant de la myomatrice [4]. Dans le muscle squelettique, COLVI est produit par les fibroblastes et une question non résolue est de comprendre comment l’altération de COLVI présent à l’extérieur des cellules musculaires conduit à des modifications fonctionnelles dans les fibres musculaires.

Pour tenter de répondre à cette question, plusieurs modèles de la myopathie ont déjà été générés telles qu’un modèle de souris dont le gène codant la chaîne α1 du COLVI a été invalidé ou des modèles de poisson zèbre dont l’expression de différentes chaînes α du COLVI a été transitoirement éteinte par injection de morpholinos. Parmi ces modèles, de nombreuses anomalies du muscle ont été reportées, telles qu’en particulier la réduction de force musculaire, l’altération du réticulum sarcoplasmique (RS), une transmission neuromusculaire déficiente et une dysfonction mitochondriale [5–8].Cependant, les modèles souris ne reproduisent pas les mutations retrouvées chez les patients BM et, dans le modèle poisson, l’extinction de l’expression des gènes par l’injection de morpholinos est transitoire alors que la BM est une pathologie qui s’aggrave avec l’âge. Afin de contourner ces limites, l’équipe de Florence Ruggiero (IGFL, Lyon) avec laquelle nous collaborons, a contribué à générer une lignée de poisson zèbre portant la mutation la plus fréquemment retrouvée chez les patients BM. Cette mutation provoque un saut d’exon 14 dans l’ARNm codant la chaîne α1 de COLVI (poisson col6a1^Δex14 ) [9]. Les analyses ultrastructurales chez le poisson col6a1^Δex14 ont révélé une désorganisation des myofibrilles, des altérations de la structure du RS et des mitochondries et un mauvais alignement des sarcomères, qui correspondent dans leur majorité aux caractéristiques de la BM.

Ce projet de thèse fait partie d’un programme de recherche dont l’objectif est d’utiliser le modèle de poisson zèbre col6a1^Δex14 afin de déterminer quels sont les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la BM. Notre hypothèse de travail est que le COLVI muté perturbe l’excitabilité et/ou l’homéostasie calcique musculaire. Cette hypothèse est basée sur le fait que (1) dans le modèle poisson col6a1^Δex14 la structure du réticulum sarcoplasmique (RS), qui joue un rôle central dans l’homéostasie calcique, est altérée, (2) les composants de la matrice ont été montrés réguler les canaux ioniques, (3) l’homéostasie calcique est sous le contrôle des canaux ioniques et joue un rôle crucial dans la fonction et la pathogenèse musculaire [10, 11].

Sachant que la BM est une maladie progressive, les expériences sont réalisées à partir de fibres musculaires isolées de poisson zèbre sauvages ou col6a1^Δex14−/- à différents stades de développement, 7-10 jours, 1 mois, 4 mois et 1 an. Les cellules musculaires du tronc sont isolées par traitement enzymatique et la technique de patch clamp jusqu’à un mois, puis de silicone clamp sur les animaux de quatre mois ou d’un an, est appliquée sur les fibres de type rapide afin d’enregistrer les courants ioniques en condition de potentiel imposé, en configuration cellule entière ou canal isolé, ou les variations de potentiel en condition de courant imposé. En parallèle, l’indicateur calcique indo-1 est dialysé à l’intérieur des cellules afin de mesurer les variations de Ca²⁺ intracellulaire.

Etant donné que très peu d’études électrophysiologiques ont été réalisées sur la cellule musculaire de poisson zèbre, le but sera dans un premier temps de caractériser les propriétés des canaux ioniques dans les fibres musculaires de poissons sauvages durant l’activité, au repos et en condition de stress mécanique. Plus précisément, les potentiels d’action, les courants résultant de l’ouverture des canaux sodiques et potassiques voltage-dépendants, les courants s’écoulant à travers le sarcolemme au repos et l’activité de canaux susceptibles de présenter une mécano-sensibilité seront enregistrés. Les courants générés par le changement de configuration du récepteur des dihydropyridines présent dans la membrane tubulaire musculaire et en charge du contrôle de l’ouverture des canaux calciques du RS seront aussi mesurés. Les Figures 1B, C et D présentent des exemples de tracés électrophysiologiques obtenus sur des fibres isolées de poissons sauvages. Dans un deuxième temps, l’ensemble de ces paramètres seront comparés dans les fibres de poissons mutants à différents âges.

Figure 1 Illustration des différents signaux électrophysiologiques et de mesure de Ca2+ enregistrés sur la fibre musculaire isolée de poisson zèbre sauvage. A. Image confocale en fluorescence d’une section de fibre musculaire de poisson âgé d’un an dont les membranes plasmiques de surface et tubulaire ont été marquées au di-8-ANEPPS. B. Potentiels d’action enregistrés en réponse à l’application de courants dépolarisants d’amplitudes croissantes sur une fibre de poisson de 2 mois en condition de courant imposé. C. Courants sodiques voltage-dépendants enregistrés en réponse à l’application de dépolarisations d’amplitudes croissantes sur une fibre de larve âgée de 7 jours en condition de potentiel imposé. D. Enregistrements de courants potassiques unitaires activés par des étirements membranaires induits par l’application de dépressions d’intensités croissantes dans la pipette de patch sur une cellule de poisson âgé d’un an en configuration cellule-attachée à un potentiel de maintien de 0 mV. E. Enregistrements de signaux calciques induits par des dépolarisations d’amplitudes croissantes sur une fibre de poisson âgé d’un an chargée avec l’indicateur calcique indo-1.

Figure 1 Illustration des différents signaux électrophysiologiques et de mesure de Ca2+ enregistrés sur la fibre musculaire isolée de poisson zèbre sauvage. A. Image confocale en fluorescence d’une section de fibre musculaire de poisson âgé d’un an dont les membranes plasmiques de surface et tubulaire ont été marquées au di-8-ANEPPS. B. Potentiels d’action enregistrés en réponse à l’application de courants dépolarisants d’amplitudes croissantes sur une fibre de poisson de 2 mois en condition de courant imposé. C. Courants sodiques voltage-dépendants enregistrés en réponse à l’application de dépolarisations d’amplitudes croissantes sur une fibre de larve âgée de 7 jours en condition de potentiel imposé. D. Enregistrements de courants potassiques unitaires activés par des étirements membranaires induits par l’application de dépressions d’intensités croissantes dans la pipette de patch sur une cellule de poisson âgé d’un an en configuration cellule-attachée à un potentiel de maintien de 0 mV. E. Enregistrements de signaux calciques induits par des dépolarisations d’amplitudes croissantes sur une fibre de poisson âgé d’un an chargée avec l’indicateur calcique indo-1.

De récentes expériences immunohistochimiques réalisées par nos collaborateurs ont révélé chez le poisson col6a1^Δex14 une diminution de l’expression des canaux impliqués dans la libération de Ca²⁺ par le RS, appelés récepteurs de la ryanodine de type 1 (RyR1). Ce résultat consolide notre hypothèse sur le fait que la régulation du calcium intracellulaire serait altérée chez le poisson mutant. A l’issue d’une première étape qui consistera à mesurer le Ca²⁺ cytosolique au repos, la libération de Ca²⁺ du RS induite par la dépolarisation et l’activité des pompes Ca²⁺-ATPase du RS responsables de la relaxation musculaire chez le poisson sauvage, le projet de thèse visera à déterminer si ces paramètres sont modifiés chez le poisson col6a1^Δex14 . La Figure 1E illustre les variations de Ca²⁺ intracellulaire induites par des dépolarisations d’amplitudes croissantes sur des fibres isolées de poissons sauvages.

La BM conduit au long terme à la perte de tissu musculaire. L’hypothèse actuellement la plus défendue suggère qu’un influx de Ca²⁺ exacerbé résultant en l’accumulation de Ca²⁺ cytosolique induit les processus dystrophiques [10]. Ainsi, l’entrée de Ca²⁺ spontanée dans la cellule musculaire au repos ou provoquée par la vidange calcique du RS telle qu’elle est décrite dans les muscles de mammifères sera mesurée à l’aide de la technique à très haute résolution d’extinction de la fluorescence par le Mn²⁺ en condition de potentiel imposé et comparée chez le poisson mutant à différents âges.

Devant la rareté des études fonctionnelles menées jusqu’à présent sur la cellule musculaire de poisson zèbre, ce projet de thèse permettra d’une part de constituer une base de données de référence sur les propriétés électrophysiologiques et les mécanismes de régulation du Ca²⁺ dans ce modèle. D’autre part, ce projet devrait aussi contribuer à déterminer si dans la BM l’altération d’une protéine appartenant à la matrice extracellulaire musculaire est responsable (i) d’une réduction de l’excitabilité de la cellule musculaire ou de la libération de Ca²⁺ induite par la dépolarisation, (ii) d’une surcharge calcique cytosolique, pouvant rendre compte respectivement de la faiblesse musculaire et des phénomènes dystrophiques qui caractérisent la maladie. Enfin, en déterminant quelles fonctions musculaires sont altérées dans la maladie, ce projet pourrait conduire à terme à identifier des cibles thérapeutiques pour traiter cette pathologie actuellement incurable.

Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.