 |
| |||
Med Sci (Paris). 35(10): 761–770. doi: 10.1051/medsci/2019154.La transplantation de génomes Redonner vie à des génomes bactériens naturels ou
synthétiques 1Institute of Veterinary Bacteriology, University of
Bern, PO
Box, CH-3001Bern,
Suisse 2UMR 1332 Biologie du fruit et pathologie, INRA
Bordeaux-Aquitaine, 71
avenue E. Bourlaux, 33882Villenave d’Ornon,
France 3Département de biologie, Université de
Sherbrooke, 2500
boulevard de l’université, Sherbrooke, Québec,
Canada Corresponding author. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
La quête de la cellule minimale : contexte scientifique Depuis des siècles, la question « Qu’est-ce que la vie ? » est au centre de
débats philosophiques et scientifiques pour plusieurs raisons : (1) définir
l’essence de la vie, sa signification, sa nature, son origine ; (2) comprendre
le fonctionnement d’une cellule vivante ; (3) démontrer l’existence de
potentielles formes de vie en dehors de notre planète ; et (4) démontrer la
capacité de l’humanité à créer elle-même des entités vivantes, se rapprochant ou
pas des cellules naturelles telles que nous les connaissons, pour mieux répondre
à certains de nos besoins.L’histoire des sciences nous démontre que l’étude de cas extrêmes se révèle souvent très instructive. Il n’est donc pas surprenant de constater qu’il existe un fort intérêt pour l’étude de cellules sous leur forme la plus basique ou « minimale ». En effet, depuis la découverte de l’ADN comme véritable support chimique de l’information génétique [1], la fascination autour de la création d’une cellule possédant le plus petit ensemble de fonctions (et peut-être de gènes) nécessaires et suffisants pour maintenir une forme de vie cellulaire n’a cessé de croître. Deux courants ont émergé : l’approche « constructive » (ou bottom-up), visant à construire des systèmes biologiques non naturels en s’appuyant sur l’assemblage de briques élémentaires aux fonctions définies [2–4] (→) et l’approche « réductive » (ou top-down), visant à simplifier les systèmes biologiques naturels pour mieux les comprendre et en décrypter tous les mécanismes [5] (→). (→) Voir la Nouvelle de N.Puff, m/s n° 2, février 2012, page 139, et le Dossier technique de V. Noireaux, m/s n° 12, décembre 2015, page 1126 (→) Voir la Chronique génomique de B. Jordan, m/s n° 6-7, juin-juilet 2016, page 651 Bien qu’il soit possible d’obtenir de telles cellules par réduction artificielle du matériel génétique d’organismes modèles comme Saccharomyces cerevisiae (~12 Mpb [mégapaires de bases]), Escherichia coli (~4,6 Mpb) ou Bacillus subtilis (~4,2 Mpb), une alternative consiste à utiliser des bactéries ayant perdu naturellement une grande partie de leur matériel génétique au cours de l’évolution. C’est le cas des mycoplasmes (bactéries appartenant à la classe des Mollicutes) considérés comme les meilleurs représentants de la cellule minimale naturelle et possédant des génomes compris entre 0,58 et 1,35 Mpb. Les travaux initiaux sur ces organismes en tant que modèle minimal ont débuté dans les années 1960, avec un programme financé par la National aeronautics and space administration (NASA) qui visait à rechercher les formes de vie extraterrestre. Les instigateurs (H. Morowitz et M. Tourtellotte) pensaient que si ces formes existaient, elles devaient être extrêmement simples et s’intéressèrent aux plus petits organismes vivants doués de réplication autonome sur notre planète [4]. Dans les années 1980, H. Morowitz proposa ensuite l’idée de définir en terme moléculaire la machinerie complète d’un mycoplasme en réalisant une carte physique et fonctionnelle du génome [6]. Cette idée ne fut pas suivie immédiatement par la communauté internationale, mais quelques projets indépendants de séquençage à grande échelle débutèrent dans les années qui suivirent [7, 8]. Le laboratoire Harvard Genome Lab démarra le séquençage du génome de Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (~1Mpb), et R. Herrmann à l’université d’Heidelberg, celui de Mycoplasma pneumoniae (816 kilopaires de bases [kpb]). Cependant, ces génomes ne furent pas les premiers publiés. En 1995, une équipe menée par Craig Venter présentait publiquement la séquence complète du génome de Mycoplasma genitalium (580 kpb, 482 gènes) [9], la plus petite bactérie capable de se multiplier en milieu acellulaire et, encore à ce jour, la cellule naturelle représentant le mieux le concept de « cellule minimale ». Mais M. genitalium est-elle véritablement une cellule « minimale » ? Est-ce qu’un organisme possédant un génome encore plus petit pourrait vivre et se multiplier dans les meilleures conditions de vie possible, c’est-à-dire en absence de stress et en présence de tous les nutriments nécessaires à sa croissance ? Une cellule minimale ne peut pas, en effet, être dissociée de l’environnement dans lequel elle se trouve et qui permet sa croissance et il est communément accepté que différentes versions de la « cellule minimale » puissent être construites en fonction de l’environnement (ou du milieu de croissance choisi) et du type de cellule étudié [10]. L’avènement de la génomique synthétique Depuis ces premiers travaux, les méthodes de séquençage de génomes ont connu des
progrès fulgurants. Désormais, avec l’émergence de techniques de synthèse d’ADN,
nous assistons à l’avènement d’une nouvelle discipline : la « génomique
synthétique » [53]
(→) permettant, non plus seulement de lire, mais d’écrire (de
façon rationnelle), synthétiser et assembler des génomes entiers dans le but de
produire des cellules viables aux propriétés biologiques entièrement maîtrisées.
Un des premiers défis de la génomique synthétique a été de développer des
méthodes de construction de génomes complets afin de produire un microorganisme
contrôlé par un génome entièrement synthétique. Ce rêve est devenu réalité en
2010 avec la création de Mycoplasma mycoides subsp.
capri JCVI-syn1.0 (Mmc JCVI-syn1.0),
premier organisme dont le génome a été reconstruit en laboratoire [11]. Cela a été suivi,
quelques années plus tard, par la création de Mmc JCVI-syn3.0,
la première cellule bactérienne « quasi-minimale » contrôlée par un génome
synthétique possédant le nombre quasiminimal de gènes nécessaire à la vie en
condition contrôlée [12].(→) Voir la Synthèse de V. Baby et al., page 753 de ce numéro Ces deux accomplissements phares de la génomique synthétique marquent le point culminant de plus de vingt ans de recherche. D’un point de vue technique, deux difficultés ont dû être surmontées : (1) l’assemblage, par étapes itératives, de petits fragments d’ADN en fragments de plus en plus longs [13–16] et (2) « l’activation » des molécules nouvellement générées pour donner la vie. Les étapes initiales de l’assemblage des molécules reposaient sur des réactions réalisées in vitro suivies de leur clonage dans la bactérie Escherichia coli. Mais face à l’impossibilité de réassembler des fragments supérieurs à 250 kpb chez cette bactérie, une alternative a dû être trouvée. Pour produire le génome JCVI-syn1.0 (~1Mb), un puzzle de 1 078 fragments de 1 080 bases a dû être résolu. L’assemblage de ces éléments s’est finalement fait en utilisant la capacité naturelle de la levure Saccharomyces cerevisiae à accepter et à assembler de nombreuses molécules d’ADN étrangères entre elles. « L’activation » des molécules d’ADN nouvellement générées dans la levure a, quant à elle, été réalisée par la technique de « transplantation de génomes ». | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Les mycoplasmes sont des espèces bactériennes difficilement manipulables sur le plan génétique. Les méthodes de transformation ne sont pas disponibles pour toutes les espèces et les outils génétiques sont peu développés [17]. Lorsque les premiers génomes naturels et synthétiques de mycoplasmes ont été clonés et propagés dans la levure, la palette d’outils génétiques de cette dernière est alors devenue disponible pour modifier les génomes bactériens. Cet hôte d’accueil temporaire est alors apparu comme une plateforme potentielle d’ingénierie génomique (Figure 1).
Le clonage de génomes naturels et synthétiques dans la levure Plusieurs méthodes ont été décrites dans la littérature pour cloner dans la
levure des molécules d’ADN de la taille d’un génome. Toutes requièrent (au
préalable ou lors de l’entrée de l’ADN dans la levure) l’ajout de séquences qui
sont nécessaires au maintien du génome bactérien chez cet hôte [18, 19] : un centromère, un marqueur de
sélection et une/des origine(s) de réplication de levure (ARS,
autonomously replicating sequence) pour les génomes à fort
taux en G+C (> 40 %).À l’heure actuelle, 12 génomes de Mollicutes 1, possédant des tailles variables (0,58 à 1,8 Mpb), des taux en G+C compris entre 24 et 40 % et utilisant un code génétique standard ou alternatif, ont été clonés dans la levure (Tableau 1). Le clonage de ces génomes a été réalisé sans difficulté particulière, excepté pour le génome d’Acholeplasma laidlawii qui n’a pu être cloné qu’après suppression d’un gène codant une endonucléase [20].
En dehors des Mollicutes, les génomes de trois protéobactéries [20–22] et celui d’une cyanobactérie [23, 24], de tailles comprises entre 0,79 et 1,8 Mpb et présentant un taux en G+C allant de 31 à 57 %, ont également été clonés avec succès dans S. cerevisiae (Tableau 1). Mais le clonage des versions synthétiques et/ou réduites des génomes de Caulobacter crescentus et E. coli nécessita l’introduction d’une dizaine de séquences ARS, distribuées de façon homogène dans ces génomes pour être maintenus de façon stable dans la levure. La tentative de clonage du génome naturel de Synechococcus elongatus (2,7 Mb et 55 % de G+C) a, en revanche, échoué, tout comme celui des génomes à fort pourcentage GC de quelques autres bactéries [23]. Outre les génomes bactériens, de nombreux génomes viraux ainsi que des fragments de chromosomes eucaryotes ont été introduits dans la levure [25, 26]. La modification génétique de génomes bactériens Les méthodes de génie génétique classiquement utilisées chez la levure ont été
revisitées avant d’être appliquées aux génomes bactériens maintenus de façon
stable chez cet hôte. Ceci a notamment permis le développement de nouveaux
outils génétiques tels que le système TREC (tandem repeat with
endonuclease cleavage) [27], le TREC-IN [28] ou plus récemment, une méthode fondée sur l’utilisation
du système CRISPR/Cas9 [29].L’utilisation de la levure, comme un atelier d’ingénierie de génomes bactériens s’est révélée extrêmement puissante et a eu un impact indéniable sur l’étude des mycoplasmes. Cependant, la nécessité d’utiliser cet hôte pour l’assemblage des génomes synthétiques a également imposé des contraintes qui auraient pu compromettre les projets visant à construire les cellules « synthétiques » Mmc JCVI-syn1.0 et Mmc JCVI-syn3.0. En effet, après assemblage dans la levure, les génomes bactériens ne sont ni transcrits, ni traduits par la machinerie eucaryote [30]. De nouvelles techniques ont donc dû être développées pour extraire, manipuler, et transférer des génomes entiers dans un environnement favorable à leur expression. Cette dernière étape fait écho à la technologie de « transplantation de génomes » (TG) qui se définie comme l’installation d’un génome, naturel ou synthétique, dans un cytoplasme receveur de telle façon que le génome donneur devienne le nouveau programme de la cellule ( Figures 1 et 2 ). Véritable figure de proue de la génomique synthétique lors de son élaboration [31], la TG a forcé à elle seule le choix surprenant et inattendu de Mycoplasma mycoides subsp. capri (Mmc) comme organisme modèle pour la construction de Mmc JCVI-syn1.0. En effet, le génome ultra-minimaliste de M. genitalium (0,58 Mpb), initialement anticipé comme support génétique, n’a jamais pu être transplanté dans une cellule receveuse après avoir été pourtant entièrement synthétisé et assemblé dans la levure [32, 33]. Malgré une taille bien supérieure, le génome entier de Mmc (1,08 Mpb) fût lui transplanté avec succès. En constituant l’unique porte de sortie pour l’étude des génomes bactériens clonés dans la levure, la TG représente de ce fait le goulot d’étranglement des techniques modernes de génomique synthétique (Figure 1).
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Le principe de la transplantation de génomes (TG) consiste à immobiliser des génomes bactériens entiers en gel d’agarose afin d’en préserver l’intégrité physique puis de les introduire dans une bactérie receveuse grâce à l’ajout d’un agent fusogène, le polyéthylène glycol (PEG). Le génome donneur devient dès lors le nouveau programme de la cellule qui, en se reproduisant, donne naissance à de nouvelles cellules appelées « transplants » présentant un génotype et un phénotype identiques à celui du génome donneur (Figure 2). Les échecs répétés enregistrés lors des tentatives de TG de M. genitalium ont longtemps laissé planer l’incertitude sur la faisabilité d’une telle procédure. En choisissant cette bactérie comme cellule modèle, les chercheurs y avaient vu l’avantage d’un organisme doté d’un génome de très petite taille, plus facile à synthétiser mais n’avaient pas réalisé les difficultés à manipuler cette bactérie en laboratoire. En effet, du fait de leurs génomes réduits, les mycoplasmes, dans leur grande majorité, se caractérisent par une croissance lente et fastidieuse nécessitant un milieu riche [34]. M. genitalium en est l’un des exemples les plus flagrants avec un temps de génération supérieur à 8 heures. En se réorientant vers des espèces comme Mmc et Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (Mcap), possédant certes des génomes plus grands, mais ayant un temps de duplication plus court (de l’ordre de 90 min), les chances de réussite se sont grandement améliorées [35]. Les essais de transformations de Mcap et Mmc avec des petites molécules d’ADN ont mis en évidence la capacité, quasi unique au sein des mycoplasmes, de Mcap à pouvoir accueillir et répliquer des plasmides portant les origines de réplication chromosomique (oriC) de différents Mollicutes (dont certains phylogénétiquement éloignés) [36]. L’utilisation de Mcap comme cellule receveuse pour la TG s’est dès lors imposée d’elle-même. Les premiers essais visant à transplanter le génome d’une espèce proche d’un point de vue phylogénétique (Mmc) dans Mcap ont tout d’abord été réalisés avec des génomes directement isolés à partir d’une culture bactérienne pure. Cette transplantation, appelée transplantation « bactérie-bactérie » a permis de donner naissance aux premiers transplants viables [31]. Dans un deuxième temps, le processus a été adapté à la transplantation de génomes bactériens préalablement clonés dans la levure [18]. Cette transplantation « levure-bactérie » nécessite la dégradation de la paroi de la levure par traitement enzymatique (par la zymolyase qui hydrolyse les glucanes de la paroi fongique) permettant de libérer le génome bactérien avant sa transplantation dans la cellule receveuse en suivant un protocole similaire à la transplantation « bactérie-bactérie » [36]. À ce jour, le mécanisme d’entrée du génome donneur dans la cellule receveuse n’est pas clairement compris. Les mycoplasmes ne possédant pas de paroi cellulaire, leur membrane plasmique est directement en contact avec l’extérieur [37]. La présence de PEG, emprunté aux techniques de transformation de cellules eucaryotes, favorise la fusion des membranes cellulaires. Il est de ce fait probable que l’entrée du génome se fasse soit par invagination de la membrane plasmique, soit par la formation d’un syncytium cellulaire qui pourrait emprisonner l’ADN génomique lors de sa formation (Figure 2). Bien qu’établie avec succès dès 2007, la TG reste, à plus d’un titre, un mystère. Comment le génome entre-t-il dans la cellule receveuse ? Le génome de la cellule receveuse joue-t-il un rôle dans l’entrée du génome bactérien dans la cellule et, si oui, lequel ? Quel est l’impact de l’absence de paroi cellulaire dans un tel processus ? Plus généralement, quels sont les facteurs qui gouvernent la compatibilité entre le génome entrant et la cellule receveuse ? La réponse à ces questions pourrait certainement permettre d’étendre cette technique à d’autres espèces bactériennes. En effet, en levant le verrou que représente la TG, plusieurs techniques de génomique synthétique seraient applicables à des bactéries pour lesquelles n’existent pas à ce jour d’outils génétiques efficaces (Chlamydia, Brucella, etc.). En attendant de comprendre ce processus, des facteurs pouvant favoriser ou au contraire gêner la TG ont été identifiés. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
La distance phylogénétique donneur/receveur Lors de son entrée dans la cellule receveuse, le génome donneur est « nu »,
c’est-à-dire sans aucune protéine et/ou facteur nécessaire à sa propre
expression. La capacité de la machinerie moléculaire de la cellule receveuse à «
prendre en charge » le génome entrant, au minimum lors du premier cycle
cellulaire, apparaît donc comme la condition sine qua non pour
que ce dernier devienne le nouveau programme de la cellule (étape
d’initialisation). La cellule receveuse doit être capable de transcrire et
traduire les gènes présents dans le génome entrant, jusqu’à que ce dernier soit
en mesure de le faire et d’assurer la réplication de son génome et la
reproduction de la cellule. Les machines moléculaires de la cellule receveuse et
le génome donneur doivent donc être compatibles (Figure 3). Dans les travaux princeps,
l’utilisation de deux espèces bactériennes phylogénétiquement proches
(Mmc et Mcap) n’a pas été le choix du
hasard et a certainement été un facteur clé dans la mise en place du processus.
Une étude récente, cherchant à évaluer le degré de compatibilité nécessaire
entre la cellule donneuse et le génome donneur a confirmé qu’il existait une
corrélation inverse entre la distance phylogénétique et l’efficacité de
transplantation [36]. En effet, plus le
génome donneur est proche d’un point de vue phylogénétique de celui de la
cellule receveuse, plus l’efficacité de transplantation est élevée. Cette
corrélation a été retrouvée qu’il s’agisse de transplantations réalisées à
partir de génomes isolés de Mollicutes ou bien de génomes
clonés dans la levure. Une limite de compatibilité semble avoir été atteinte
pour la cellule receveuse Mcap et se situerait entre les
espèces Mesoplasma florum [30] et Spiroplasma citri pour laquelle aucun
transplant n’a pu être obtenu [36]. Ces
résultats indiquent que l’initialisation du génome donneur se fait correctement
lorsque le core-proteome (protéome conservé)
du donneur et de la cellule receveuse possèdent un pourcentage de similarité
supérieur à 90 % [36]. Il est fort
probable que la conservation et la similitude des protéines impliquées dans la
transcription et la traduction soient un facteur décisif.
La réplication et la ségrégation de l’ADN sont également des processus vitaux dans la cellule. Ils assurent que chaque cellule fille, issue de la division cellulaire, hérite d’une copie identique du matériel génétique de la cellule mère. Cependant, ils ne semblent pas pouvoir expliquer, à eux seuls, l’échec de la transplantation entre espèces éloignées. Pour le couple Mcap/S. citri par exemple, il a été montré que Mcap pouvait répliquer et propager de façon stable un plasmide portant l’origine de réplication chromosomique (oriC) de S. citri, confirmant que les complexes protéiques d’initiation de la réplication Mcap sont recrutés au niveau de l’oriC de S. citri et que l’amorçage de la réplication se fait correctement. En revanche, tous les essais de TG de S. citri dans Mcap sont restés vains. Lors de cette étude, un cas particulier est apparu et vient complexifier cette théorie. Pourtant bien plus proche phylogénétiquement de la cellule receveuse Mcap que M. florum, la TG de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides (Mmm) s’est avérée moins efficace dans le cadre d’une transplantation bactérie-bactérie et impossible pour une transplantation levure-bactérie [36]. Ce résultat suggère que de nombreux facteurs, potentiellement intrinsèques à certaines espèces, peuvent interférer avec le processus de TG. L’ensemble de ces facteurs, détaillés ci-dessous, sont résumés dans la Figure 4 .
Les facteurs spécifiques d’espèces Les nucléases Les nucléases sont des enzymes capables d’hydrolyser les liaisons
phosphodiester entre deux nucléotides adjacents. Certaines bactéries, dont
les mycoplasmes, expriment des nucléases de surface liées à la membrane ou
excrétées dans le milieu extérieur [38, 39]. Ces enzymes peuvent potentiellement cliver le génome
donneur avant même son entrée dans la cellule et doivent donc être
neutralisées avant de mettre l’ADN au contact des cellules receveuses
(Figure
4A). Il a été démontré, dans le cadre du clonage du génome d’Acholeplasma laidlawii dans la levure, que l’activité de telles nucléases peut aussi avoir des effets particulièrement délétères à d’autres étapes que celle de la TG [20]. Les facteurs du soi et du non-soi Après son entrée, le génome entrant doit également être « toléré » par la
cellule receveuse. Au cours de leur évolution, les bactéries ont développé
un ensemble de systèmes leur permettant de faire la distinction entre leur
propre ADN (soi) et de l’ADN étranger (non-soi) et ainsi prévenir l’invasion
d’agents opportunistes. Les systèmes les mieux caractérisés sont les
systèmes de restriction-modification (R-M) [18, 40]
et le système de défense adaptatif CRISPR/Cas9 [41, 42], bien que d’autres systèmes aient
été décrits récemment [43, 44]. Dans le cadre de la TG, le génome « entrant » peut être
considéré comme un ADN étranger par la cellule receveuse. Un système de R-M
a été identifié chez Mcap, il s’agit d’un système de type
II2, composé de deux gènes codant
des méthyltransférases et d’un gène codant une enzyme de restriction. Les
méthyltransférases sont capables de méthyler l’ADN au niveau des séquences
CCATC et l’enzyme de restriction peut cliver l’ADN lorsque ces sites ne sont
pas méthylés. L’implication de ce système a été démontrée lors des premiers
essais de transplantation du génome de Mmc cloné dans la
levure, cette dernière ne méthylant que peu ou pas son ADN (Figure 4B). La méthylation
in vitro du génome de Mmc avec des
extraits cellulaires de mycoplasmes Mcap, ou l’utilisation
d’un mutant de Mcap n’exprimant plus l’enzyme de
restriction, a permis de contourner ce problème [18]. Le système toxine-antitoxine Certaines bactéries produisent des systèmes toxine-antitoxine (TA) [45]. Ces systèmes
sont des modules génétiques composés d’une toxine (ARNm ou protéine) et
d’une antitoxine protéique antagoniste inhibant la fonction toxique. Cette
dernière est généralement moins stable que la toxine et se dégrade
rapidement sous l’effet de différents stress cellulaires [45]. Il semble que certains génomes de
mycoplasmes possèdent au moins un système de ce type (F Labroussaa,
communication personnelle). Dans le cas où le génome entrant et celui de la
cellule receveuse ne possèdent pas le même système toxine-antitoxine, il est
possible qu’une toxine produite par le génome de la cellule receveuse
persiste plus longtemps que sa partenaire dans le cytoplasme et provoque la
mort cellulaire des transplants. La recombinaison homologue Lors de l’entrée du génome donneur dans la cellule receveuse, les deux
génomes (à minima) (voir la formation de syncitium,
Figure 2
) peuvent potentiellement interagir et des évènements de
recombinaison homologues ou illégitimes sont dès lors possibles
(Figure 4C).
De tels évènements pourraient aboutir à des cellules abritant des génomes
mosaïques ou hybrides et non à des cellules dont le génome endogène a été
entièrement remplacé par le génome exogène. Des génomes mosaïques ont été
observés chez Mycoplasma agalactiae à la suite d’événements
de conjugaison d’éléments intégratifs et conjugatifs [46], démontrant la réelle
possibilité que ces événements puissent se produire lors d’expériences de
TG. Néanmoins, ce phénomène n’a, à ce jour, jamais été mis en évidence lors
de ces expériences. L’absence de système de recombinaison homologue efficace chez les mycoplasmes a certainement été un autre facteur facilitant le développement du protocole de TG. Cependant, chez des bactéries possédant des systèmes de recombinaison actifs, ce phénomène pourrait jouer un rôle important. Cytosquelette Contrairement aux mycoplasmes du groupe phylogénétique
Mycoides auquel appartiennent Mcap et
Mmc, M. genitalium et M. pneumoniae
présentent une structure polaire multifonctionnelle (ou tip), essentielle à
la colonisation de l’hôte, à la motilité et à la division cellulaire [47]. Cette dernière
est associée à un cytosquelette interne dense (Figure 4D), indispensable à son assemblage
et à sa fonction. Les échecs récurrents de TG observés chez ces espèces
pourraient être liés à la présence de ces édifices moléculaires qui
constitueraient une sorte de barrière « physique » et s’opposeraient à
l’entrée de grandes molécules d’ADN. Les échecs rencontrés lors des expériences de TG entre Mcap et S. citri, pourraient également être en lien avec le cytosquelette, mais de façon différente. S. citri possède naturellement une forme spiralée due à la présence d’un cytosquelette interne unique chez les mycoplasmes, et éventuellement difficile à reformer dans la cellule receveuse Mcap. Les éléments mobiles Certaines pistes de recherche désignent les séquences d’insertions (IS)
présentes en très grand nombre dans le génome de Mmm
(environ 13 % du génome) comme barrières possibles à la TG. L’absence de
régulation des éléments des IS chez Mcap (dont le génome
est naturellement dépourvu de ces séquences), pourrait provoquer des
évènements de transpositions incontrôlés et l’insertion anarchique de ces
séquences au niveau de gènes essentiels. L’étude de la régulation de ces IS
chez les mycoplasmes est actuellement en cours. La mise au point d’un
processus de transplantation intra-espèce, utilisant Mmm
comme cellule receveuse, pourrait limiter l’impact de ce phénomène, mais sa
mise en place s’avère fastidieuse. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
La TG peut être vue comme un nouveau mode de transfert d’ADN chez les bactéries. Cependant, contrairement à des mécanismes bien connus comme la transformation bactérienne, la conjugaison et la transduction, la TG reste pour l’instant limitée au laboratoire. De plus, mettant en jeu de l’ADN « déprotéinisé », il est peu probable que ce phénomène ait lieu en condition naturelle. D’un point de vue plus conceptuel, la TG paraît être bien plus qu’une simple technique de laboratoire. Elle rejoint les préceptes issus des expériences de Griffith [1] et d’Avery, McLeod et McCarty [48], en démontrant que l’ADN est le véritable support de l’information génétique. En effet, en changeant complétement le programme génétique d’une cellule, sa « fiche d’identité » ou son phénotype (Mcap vs Mmc) change également radicalement. En revanche, la TG ne représente pas la création de la vie stricto senso, comme il a souvent été évoqué. À l’instar de la division cellulaire, elle garantit la continuité de la vie par le biais de la propagation d’une série de fonctions de base et communes à toutes les cellules et conservées quelle que soit leur « fiche d’identité », assurant ainsi l’ensemble des activités nécessaires à la réplication du génome et à la reproduction de la cellule (Figure 2). Néanmoins, et contrairement à la division cellulaire qui donne naissance à deux cellules filles génotypiquement et phénotypiquement identiques, la TG donne naissance à une cellule fille dont le génome peut être différent de celui d’autres espèces bactériennes naturelles (Figure 2). Par conséquent, elle permet la construction de nouvelles formes de vie qui ne sont pas directement le fruit de l’évolution, rejoignant ainsi parfaitement la définition communément admise de la génomique synthétique. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Le domaine de la génomique synthétique a pris de l’ampleur ces dernières années, à la fois au travers d’aboutissements importants, comme la création des premières cellules contrôlées par des génomes synthétiques, mais aussi en stimulant le développement d’outils et de méthodologies innovantes (synthèse de génomes complets, clonage, manipulation et transplantation de génomes entiers). En combinant ces nouvelles approches de génomique synthétique à des approches bio-informatiques, l’exploration des fonctions essentielles à la vie d’une cellule minimale change désormais d’échelle. En dehors des réponses aux questions sur le fonctionnement du vivant, ces technologies peuvent également offrir de nombreuses applications, notamment dans les domaines de la biotechnologie (reprogrammation métabolique de bactéries) et/ou de la vaccinologie. En effet, l’un des principaux problèmes rencontrés pour l’étude de nombreux agents pathogènes, est l’inefficacité, voire le manque total pour certains patho-systèmes, d’outils moléculaires nécessaires à l’étude fonctionnelle de leurs gènes. Ceci rend extrêmement complexe la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénicité de ces microorganismes et, de ce fait, la mise en place de méthodes prophylactiques et/ou l’établissement de traitements durables et efficaces. Un des objectifs principaux de la génomique synthétique sera certainement d’adapter les technologies existantes à de nouvelles espèces bactériennes, génétiquement non modifiables à l’heure actuelle, afin de mettre en place des « plateformes d’ingénierie génomique » qui puissent être utilisées ultérieurement pour la recherche fondamentale et appliquée. En ce qui concerne les Mollicutes, les récentes publications portant sur la compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogénicité des mycoplasmes [49–51] démontrent déjà l’apport indéniable des techniques de génomique synthétique. Néanmoins, elles sont encore restreintes à un trop petit nombre d’espèces bactériennes et de laboratoires, principalement à cause de la TG. À notre connaissance, les techniques de génomique synthétique appliquées aux mycoplasmes sont, à l’heure actuelle, maîtrisées par quatre laboratoires à travers le monde (JCVI à Rockville, États-Unis ; l’INRA à Bordeaux ; l’université de Sherbrooke à Québec, Canada ; et l’Institut de bactériologie vétérinaire – IVB - à Berne, Suisse). Les techniques de synthèse et de réassemblage de génomes entiers dans la levure commencent, quant à elles, à être appliquées à d’autres espèces bactériennes ; la création du premier génome entièrement synthétique de Caulobacter ethensis-2.0 est le dernier exemple en date [52]. En revanche, aucune méthode de TG n’a pour l’instant abouti en dehors des Mollicutes. La recherche de nouvelles cellules receveuses, phylogénétiquement proches du génome donneur d’intérêt, permettrait certainement de s’affranchir de l’incompatibilité des machineries cellulaires donneur/receveur au cours de la TG. Cependant, cette approche nécessite de mettre au point de nouveaux protocoles de transplantation pour chaque espèce considérée, et cela peut se révéler extrêmement fastidieux. Concernant les Mollicutes, la production d’une cellule receveuse « optimisée », fondée sur le génome de Mcap génétiquement modifiée, est une autre une piste de recherche intéressante. En effet, l’introduction dans le génome de la cellule receveuse de gènes impliqués dans les principales fonctions cellulaires du génome donneur (transcription, traduction, réplication) ou dans la régulation de certaines barrières à la transplantation précédemment identifiées (RM, IS, etc.), pourrait permettre d’améliorer le degré de compatibilité et l’installation de génomes de mycoplasmes non « transplantables » à ce jour. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Les auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2
Système de R-M de type II : la méthyltransférase et l’enzyme de restriction sont
produites sous la forme de protéines distinctes n’agissant pas en complexe.
Chacune des deux protéines rivalise pour l’accès à un site de reconnaissance
commun et unique afin de pouvoir exercer sa fonction. La méthyltransférase
(monomère) agit en méthylant ce site un brin à la fois. L’enzyme de restriction
(homodimère), clive l’ADN à une position définie proche de la séquence de
reconnaissance ou bien à l’intérieur de celle-ci.
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.
Puff
N
. Un modèle avancé de cellule synthétique
minimale . Med Sci (Paris).
2012; ; 28 :
:139.–41. 7.
Bork
P
,
Ouzounis
C
,
Casari
G
, et al.
Exploring the Mycoplasma capricolum genome: a
minimal cell reveals its physiology . Mol
Microbiol.
1995; ; 16 :
:955.–67. 8.
Himmelreich
R
,
Hilbert
H
,
Plagens
H
, et al.
Complete sequence analysis of the genome of the bacterium
Mycoplasma pneumoniae
. Nucleic Acids Res.
1996; ; 24 : :4420.. 9.
Fraser
CM
,
Gocayne
JD
,
White
O
, et al.
The minimal gene complement of Mycoplasma
genitalium
. Science.
1995; ; 270 :
:397.–403. 10.
Porcar
M
,
Danchin
A
,
de Lorenzo
V
, et al.
The ten grand challenges of synthetic life .
Syst Synth Biol.
2011; ; 5 :
:1.–9. 11.
Gibson
DG
,
Glass
JI
,
Lartigue
C
, et al.
Creation of a bacterial cell controlled by a chemically
synthesized genome . Science.
2010; ; 329 :
:52.–6. 12.
Hutchison
CA
,
Chuang
RY
,
Noskov
VN
, et al.
Design and synthesis of a minimal bacterial
genome . Science.
2016; ; 351 :
:aad6253.. 13.
Gibson
DG
,
Young
L
,
Chuang
R-Y
, et al.
Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred
kilobases . Nat Methods.
2009; ; 6 :
:343.–5. 14.
Gibson
DG
,
Smith
HO
,
Hutchison
CA
, et al.
Chemical synthesis of the mouse mitochondrial
genome . Nat Methods.
2010; ; 7 :
:901.–3. 15.
Itaya
M
,
Fujita
K
,
Kuroki
A
,
Tsuge
K
. Bottom-up genome assembly using the
Bacillus subtilis genome vector .
Nat Methods.
2008; ; 5 :
:41.–3. 16.
Itaya
M
,
Tsuge
K
,
Koizumi
M
,
Fujita
K
. Combining two genomes in one cell: stable cloning
of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus
subtilis 168 genome . Proc Natl Acad Sci
USA.
2005; ; 102 :
:15971.–6. 17.
Halbedel
S
,
Stülke
J
. Tools for the genetic analysis of
Mycoplasma
. Int J Med Microbiol.
2007; ; 297 :
:37.–44. 18.
Lartigue
C
,
Vashee
S
,
Algire
MA
, et al.
Creating bacterial strains from genomes that have been cloned and
engineered in yeast . Science.
2009; ; 325 :
:1693.–6. 19.
Benders
GA
,
Noskov
VN
,
Denisova
EA
, et al.
Cloning whole bacterial genomes in yeast .
Nucleic Acids Res.
2010; ; 38 :
:2558.–69. 20.
Karas
BJ
,
Tagwerker
C
,
Yonemoto
IT
, et al.
Cloning the Acholeplasma laidlawii PG-8A genome
in Saccharomyces cerevisiae as a yeast centromeric
plasmid . ACS Synth Biol.
2012; ; 1 :
:22.–8. 21.
Zhou
J
,
Wu
R
,
Xue
X
,
Qin
Z
. CasHRA (Cas9-facilitated Homologous Recombination
Assembly) method of constructing megabase-sized DNA .
Nucleic Acids Res.
2016; ; 44 : :e124.. 22.
Rideau
F
,
Le Roy
C
,
Descamps
ECT
, et al.
Cloning, stability, and modification of Mycoplasma
hominis genome in yeast . ACS Synth
Biol.
2017; ; 6 :
:891.–901. 23.
Noskov
VN
,
Karas
BJ
,
Young
L
, et al.
Assembly of large, high G+C Bacterial DNA fragments in
yeast . ACS Synth Biol.
2012; ; 1 :
:267.–73. 24.
Tagwerker
C
,
Dupont
CL
,
Karas
BJ
, et al.
Sequence analysis of a complete 1.66 Mb Prochlorococcus
marinus MED4 genome cloned in yeast .
Nucleic Acids Res.
2012; ; 40 :
:10375.–83. 25.
Vashee
S
,
Stockwell
TB
,
Alperovich
N
, et al.
Cloning, assembly, and modification of the primary human
cytomegalovirus isolate toledo by yeast-based transformation-associated
recombination . mSphere.
2017; ; 2((5)) :
:e00331.–17. 26.
Oldfield
LM
,
Grzesik
P
,
Voorhies
AA
, et al.
Genome-wide engineering of an infectious clone of herpes simplex
virus type 1 using synthetic genomics assembly methods .
Proc Natl Acad Sci U S A.
2017; ; 114 :
:E8885.–94. 27.
Noskov
VN
,
Segall-Shapiro
TH
,
Chuang
R-Y
. Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage
(TREC): a seamless modification tool for genome engineering in
yeast . Nucleic Acids Res.
2010; ; 38 :
:2570.–6. 28.
Chandran
S
,
Noskov
VN
,
Segall-Shapiro
TH
, et al.
TREC-IN: gene knock-in genetic tool for genomes cloned in
yeast . BMC Genomics.
2014; ; 15 : :1180.. 29.
Tsarmpopoulos
I
,
Gourgues
G
,
Blanchard
A
, et al.
In-yeast engineering of a bacterial genome using
CRISPR/Cas9 . ACS Synth Biol.
2016; ; 5 :
:104.–9. 30.
Baby
V
,
Labroussaa
F
,
Brodeur
J
, et al.
Cloning and transplantation of the Mesoplasma
florum genome . ACS Synth Biol.
2018; ; 7 :
:209.–17. 31.
Lartigue
C
,
Glass
JI
,
Alperovich
N
, et al.
Genome transplantation in bacteria: changing one species to
another . Science.
2007; ; 317 :
:632.–8. 32.
Gibson
DG
,
Benders
GA
,
Andrews-Pfannkoch
C
, et al.
Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a
Mycoplasma genitalium genome .
Science.
2008; ; 319 :
:1215.–20. 33.
Gibson
DG
,
Benders
GA
,
Axelrod
KC
, et al.
One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to
form a complete synthetic Mycoplasma genitalium
genome . Proc Natl Acad Sci USA.
2008; ; 105 :
:20404.–9. 34.
Tully
JG
,
Whitcomb
RF
,
Clark
HF
,
Williamson
DL
. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and
vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma .
Science.
1977; ; 195 :
:892.–4. 35.
Lartigue
C
,
Blanchard
A
,
Renaudin
J
, et al.
Host specificity of mollicutes oriC plasmids: functional analysis
of replication origin . Nucleic Acids Res.
2003; ; 31 :
:6610.–8. 36.
Labroussaa
F
,
Lebaudy
A
,
Baby
V
, et al.
Impact of donor-recipient phylogenetic distance on bacterial
genome transplantation . Nucleic Acids Res.
2016; ; 44 :
:8501.–11. 37.
Chambaud
I
,
Wróblewski
H
,
Blanchard
A
. Interactions between mycoplasma lipoproteins and
the host immune system . Trends Microbiol.
1999; ; 7 :
:493.–9. 38.
Sharma
S
,
Tivendale
KA
,
Markham
PF
,
Browning
GF
. Disruption of the membrane nuclease gene
(MBOVPG45_0215) of Mycoplasma bovis greatly reduces
cellular nuclease activity . J Bacteriol.
2015; ; 197 :
:1549.–58. 39.
Jarvill-Taylor
KJ
,
VanDyk
C
,
Minion
FC
. Cloning of mnuA, a membrane nuclease gene of
Mycoplasma pulmonis, and analysis of its expression in
Escherichia coli
. J Bacteriol.
1999; ; 181 :
:1853.–60. 40.
Algire
MA
,
Montague
MG
,
Vashee
S
, et al.
A Type III restriction-modification system in Mycoplasma
mycoides subsp. capri
. Open Biol.
2012; ; 2 : :120115.. 41.
Horvath
P
,
Barrangou
R
. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and
archaea . Science.
2010; ; 327 :
:167.–70. 42.
Vasu
K
,
Nagaraja
V
. Diverse functions of restriction-modification
systems in addition to cellular defense . Microbiol
Mol Biol Rev.
2013; ; 77 : :53.. 43.
Goldfarb
T
,
Sberro
H
,
Weinstock
E
, et al.
BREX is a novel phage resistance system widespread in microbial
genomes . EMBO J.
2015; ; 34 :
:169.–83. 44.
Ofir
G
,
Melamed
S
,
Sberro
H
, et al.
DISARM is a widespread bacterial defence system with broad
anti-phage activities . Nat Microbiol.
2018; ; 3 :
:90.–8. 45.
Makarova
KS
,
Wolf
YI
,
Koonin
EV
. Comprehensive comparative-genomic analysis of
type 2 toxin-antitoxin systems and related mobile stress response systems in
prokaryotes . Biol Direct.
2009; ; 4 : :19.. 46.
Faucher
M
,
Nouvel
L-X
,
Dordet-Frisoni
E
, et al.
Mycoplasmas under experimental antimicrobial selection: The
unpredicted contribution of horizontal chromosomal transfer .
PLoS Genet.
2019; ; 15 :
:e1007910.. 47.
Waites
KB
,
Xiao
L
,
Liu
Y
, et al.
Mycoplasma pneumoniae from the respiratory tract
and beyond . Clin Microbiol Rev.
2017; ; 30 :
:747.–809. 48.
Avery
OT
,
Macleod
CM
,
McCarty
M
. Studies on the chemical nature of the substance
inducing transformation of pneumococcal types: induction of transformation
by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from
Pneumococcus type III . J Exp
Med.
1944; ; 79 :
:137.–58. 49.
Schieck
E
,
Lartigue
C
,
Frey
J
, et al.
Galactofuranose in Mycoplasma mycoides is
important for membrane integrity and conceals adhesins but does not
contribute to serum resistance . Mol
Microbiol.
2016; ; 99 :
:55.–70. 50.
Jores
J
,
Ma
L
,
Ssajjakambwe
P
,
Schieck
E
, et al.
Removal of a subset of non-essential genes fully attenuates a
highly virulent Mycoplasma strain .
Front Microbiol.
2019; ; 10 : :664.. 51.
Jores
J
,
Schieck
E
,
Liljander
A
, et al.
In vivo role of capsular polysaccharide in
Mycoplasma mycoides
. J Infect Dis. ; 219 :
:1559.–63. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
