Les tout premiers anticorps thérapeutiques ont été produits à partir de la technologie des hybridomes développée dans les années 1970 par Köhler et Milstein [ 5] (→). La découverte fut majeure et leur valut le prix Nobel en 1984. Les lymphocytes B (splénocytes) d’une souris immunisée avec l’antigène d’intérêt sont fusionnés avec des cellules immortalisées et non productrices d’anticorps. La culture in vitro de ce mélange cellulaire est réalisée en présence d’un système inhibiteur permettant uniquement la survie des cellules fusionnées ou hybridomes. Les clones (issus d’un hybridome unique produisant un seul type d’anticorps) peuvent être isolés et utilisés pour la production d’anticorps à grande échelle.

(→) voir J.L. Teillaud, page 1010 ; R. Abès et al., page 1011

Bien que les premiers anticorps recombinants aient été produits avec cette technologie, elle présente de sérieux inconvénients. Les Acm sont d’origine murine et leur injection répétée chez l’homme déclenche une réaction immunitaire avec formation d’anticorps dirigés contre ces anticorps de souris. Ce mécanisme de défense a pour conséquence l’élimination rapide des anticorps murins de l’organisme, réduisant ainsi sérieusement l’efficacité thérapeutique (→). Il a été démontré qu’environ 80 % des patients qui avaient reçu le premier anticorps murin commercial, OKT3, utilisé dans la prévention du rejet de greffe, développaient une réaction immunitaire [ 6]. Cette immunogénicité des anticorps murins chez l’homme explique que l’on ne trouve à ce jour que cinq Acm de souris sur le marché (→).

(→) voir P. Stas et I. Lasters, page 1070 ; G. Paintaud, page 1057

(→) voir A. Beck et al., Tableau I, page 1026

De nouveaux modèles cellulaires pourraient prochainement bousculer l’ordre établi avec les lignées de rongeurs. La lignée Per.C6^® provient de cellules de rétine humaine immortalisées et ont un potentiel de culture à très haute densité. Plusieurs études ont démontré la capacité de Per.C6^® de produire un Acm avec des rendements atteignant 10 g/l [ 7, 8]. Par nature, les protéines recombinantes issues de cette lignée ont un profil de glycosylation humain. Ces avantages sont des éléments déterminants pour permettre à la lignée Per.C6^® de devenir une plateforme de production d’Acm.

D’autres lignées sont actuellement utilisées en développement : les cellules aviaires EBx^® de la société Vivalis (→) et le myélome de rat YB2/0 des Laboratoires LFB (Laboratoire français du fractionnement et des biotechnologies) (→). Leur avantage principal est de produire des molécules avec un faible taux de fucose, ce qui en principe permet d’augmenter leur capacité de déclencher la cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC), une des fonctions effectrices des Acm.

(→) voir S. Olivier et M. Mehtali, page 1163

(→) voir R. Urbain et al., page 1141

Les bactéries, levures, champignons filamenteux, microalgues, plantes et animaux transgéniques sont autant de systèmes de production potentiellement utilisables pour la production d’anticorps [ 31, 32] (→). Les levures Pichia pastoris ont été modifiées génétiquement pour permettre l’expression de protéines avec des motifs humains de glycosylation. L’immunogénicité des biomolécules recombinantes est ainsi fortement réduite. Bien que la productivité de Pichia pastoris soit significativement inférieure à celle des cellules de mammifères décrites ci-dessus, des publications récentes décrivent des titres en protéines dépassant 2 g/l [ 9]. Ce système d’expression économiquement avantageux pourrait donc être utilisé dans un futur proche pour des productions industrielles.

(→) voir S. Olivier et M. Mehtali, page 1163

À la différence des lignées de rongeurs mentionnées plus haut, tous ces systèmes émergents qui ne sont pas encore enregistrés devront se confronter à une expertise réglementaire pointilleuse pour espérer se qualifier comme système de production.

L’insertion du vecteur d’expression au niveau chromosomique est un phénomène aléatoire. Si l’intégration se produit dans une région hautement condensée de la chromatine, on observera généralement un faible taux d’expression de la protéine recombinante. L’environnement génomique du site d’intégration et la présence de modifications épigénétiques de l’ADN (méthylation) et des histones (acétylation, méthylation, phosphorylation, etc.) influencent considérablement l’efficacité de transcription du transgène. Les approches STAR (stabilizing and antirepressor), S/MAR (matrix associated regions ¹) ou UCOE (ubiquitous chromatin opening elements² ), pour ne citer qu’elles, permettent l’ajout de séquences particulières d’ADN à proximité de l’insert codant l’Acm et induisent un environnement chromatinien favorable à la transcription [ 10]. Ces technologies nouvelles peuvent potentiellement simplifier la sélection de cellules ayant un haut rendement de production après transfection et également réduire les temps de développement [ 11].

L’ingénierie métabolique des cellules permet également d’améliorer ou de contrôler la qualité des Acm produits. La présence de motifs particuliers de glycosylation influence les interactions des Acm avec certaines cellules du système immunitaire. Ainsi, une lignée CHO dont le gène de la fucosyl transférase a été supprimé a permis l’expression d’Ac non fucosylés qui déclenchent une activité ADCC multipliée par 100. D’autre part, des modifications de la région Fc de l’Acm ont été introduites qui augmentent l’affinité de cette région vis-à-vis de son récepteur, améliorant la stabilité de l’anticorps in vivo [ 12– 14].

Des modifications cellulaires ont été également décrites pour prolonger la durée de culture des cellules en bioréacteur. Une des stratégies se base par exemple sur l’utilisation d’ARN interférents pour inhiber des gènes proapoptotiques tels que Bax, Bak ou caspase 3 [ 15, 16]. À l’inverse, des copies additionnelles de gènes anti-apoptotiques tels que Bcl-2 et Bcl-X_L ont été insérées dans la cellule productrice, augmentant sa survie, et donc entraînant l’augmentation des rendements de production [ 17]. Dans le cas d’une lignée surexprimant la protéine Bcl-X_L, une augmentation de 80 % de la productivité volumétrique d’un anticorps humanisé a été démontrée par comparaison à celle de la cellule parentale [ 18].

L’amélioration de l’activité transcriptionnelle induite par ces modifications peut avoir des conséquences sur la capacité cellulaire d’assemblage des polypeptides tels que les anticorps. S’ils sont incorrectement ou incomplètement repliés, ils seront sécrétés en moins grande quantité et leur structure sera hétérogène. À ce stade, les protéines chaperonnes jouent un rôle essentiel pour assurer l’assemblage, le trafic cellulaire et la sécrétion des anticorps. Plusieurs travaux décrivent comment il est possible de modifier cette machinerie cellulaire, en jouant par exemple sur les niveaux relatifs d’expression des protéines BiP (immunoglobulin heavy chain binding protein) et PDI (protein disulfide isomerase) [ 19, 20].

De très nombreuses autres démarches ont été documentées dont l’ambition est d’améliorer le potentiel des lignées cellulaires pour la production d’anticorps recombinants (voir la revue de Barnes [10]). Même si ces principes généraux sont pour beaucoup au stade expérimental, il y a fort à parier que certaines approches se développeront jusqu’à être appliquées au stade industriel dans les prochaines années.

Chaque stade impliquant l’utilisation d’Acm, de la recherche à la production industrielle, met en jeu des quantités et une qualité d’anticorps notablement différentes. Les exigences de pureté et de caractérisation sont évidemment croissantes et maximales lors de l’utilisation chez l’homme. Alors que quelques milligrammes suffisent pour des études au stade recherche, il n’est pas rare de produire plusieurs centaines de Kg du même anticorps destiné à certaines indications oncologiques (Figure 1).

Au niveau des procédés de préparation des protéines recombinantes, on distingue généralement les plates-formes upstream et downstream, respectivement dédiées aux activités de culture cellulaire et de purification [ 21].

Elle comprend toutes les étapes qui vont de la mise en culture du clone producteur de l’Acm jusqu’à la séparation des cellules et du milieu de culture produits par le dernier bioréacteur. Par extension, les étapes préliminaires incluant la génération de la lignée cellulaire (après transfection avec le vecteur d’intérêt), la sélection du clone et la réalisation de la banque cellulaire peuvent être inclues dans la plateforme upstream.

La sélection d’un clone, l’optimisation des conditions de culture et le changement d’échelle (de quelques millilitres à plusieurs milliers de litres) requièrent un véritable savoir-faire. Avec l’expertise et les cycles d’optimisation durant les phases de développement, il n’est pas rare d’obtenir des productivités cellulaires 5 à 10 fois supérieures à celle du clone initial. L’avantage économique est alors indéniable pour la mise en œuvre du procédé au stade industriel. Quel que soit le degré d’optimisation, l’enjeu, avant de passer à l’industrialisation, sera de démontrer la maîtrise du procédé tout en assurant la qualité finale du produit.

Les technologies de production ont notablement évolué ces dernières années, même si le principe de culture en bioréacteur reste le même. L’émergence des systèmes à usage unique a grandement facilité le travail des développeurs et producteurs [ 22, 23]. Il est aujourd’hui concevable de réaliser en système à usage unique toutes les étapes de culture cellulaire depuis la décongélation du tube de cellules de la banque cellulaire jusqu’au bioréacteur de 1 000 ou 2 000 litres. Ces bioréacteurs sont équipés d’une poche plastique stérile, d’un système d’agitation et de toutes les « connectiques » pour le contrôle de la culture cellulaire et les transferts de milieux. En fin de culture, les cellules sont récupérées, la poche est remplacée par une neuve, permettant au bioréacteur d’être de nouveau rapidement opérationnel. La plupart des équipements périphériques du bioréacteur (préparation des milieux, connectiques, filtration, etc.) sont également conçus sous une forme à usage unique. L’absence de stérilisation, de nettoyage et de contamination croisée sont les atouts principaux de ces systèmes. La limite de capacité actuelle des bioréacteurs (2 000 L) est compatible avec la production de lots d’anticorps destinés aux essais cliniques ou pour des petits marchés thérapeutiques (marchés de niche, nécessitant une production n’excédant pas quelques Kg). Dans le cadre de la production commerciale d’anticorps destinés au domaine oncologique par exemple, l’utilisation de bioréacteurs de conception plus traditionnelle et de grande capacité reste requise (jusqu’à 20 000 litres). Le lecteur pourra se référer à une revue récente traitant en profondeur les spécificités de la plateforme upstream [ 24].

Elle comprend l’ensemble des étapes permettant d’obtenir un anticorps purifié à partir du milieu de culture clarifié (débarrassé des cellules). Le principe actif obtenu devra ensuite être traité selon une formulation appropriée avant d’être flaconné pour les essais cliniques ou la commercialisation. Dans le cas des anticorps, les procédés standard de purification incluent le plus souvent une étape de chromatographie d’affinité (sur protéine A) suivie de deux étapes de chromatographie par échange d’ions ou par interaction hydrophobe. L’ensemble des méthodes mises en œuvre concourt à l’élimination des contaminants cellulaires ou apportés par le procédé (→). En particulier, les protéines contaminantes de la cellule hôte, l’ADN, la protéine A ou les virus potentiellement apportés par la lignée cellulaire doivent être éliminés ou limités à des concentrations inférieures aux normes réglementaires. Dans le cas des virus, l’élimination ou l’inactivation par au moins deux étapes orthogonales dans le procédé est un requis réglementaire. L’objectif de pureté s’accompagne d’un objectif de rendement optimal de la plateforme. Selon les choix faits par le développeur et en fonction des caractéristiques intrinsèques de l’anticorps, les rendements de purification généralement rencontrés sont de 60 à 70 %.

(→) voir L. Manache et al., page 1063

Avec l’amélioration spectaculaire des productivités cellulaires, la purification est devenue le goulet d’étranglement dans la production des anticorps [ 25]. Les étapes downstream représentent 60 à 70 % du coût global de production des anticorps. Les efforts de simplification de cette plateforme et de réduction des coûts sont devenus des enjeux majeurs. La mise au point d’alternatives à la protéine A [ 26], la création de nouvelles résines ou de nouvelles membranes de filtration chargées apporteront des solutions compétitives. De même, l’émergence des technologies à usage unique dans la plateforme downstream (filtration, préparation des tampons, connectiques, etc.) permet de réduire les temps du procédé tout en assurant la fiabilité de la qualité du principe actif. La mise à disposition rapide d’anticorps pour des essais cliniques est absolument essentielle dans le cycle de développement et la perspective de succès commercial [ 27, 28].

En parallèle des plateformes upstream et downstream, des méthodes analytiques sont mises en place pour caractériser l’anticorps d’intérêt. Compte tenu de l’exigence croissante de pureté et de caractérisation, on dispose aujourd’hui de techniques analytiques repoussant toujours plus loin les limites de quantification des subtiles variations observées dans la structure des anticorps [ 29] (→).

(→) voir L. Manache et al., page 1063