Les anticorps monoclonaux (Acm) et leurs dérivés (fragments d’anticorps seuls ou modifiés, immunoconjugués, fusions Fc, etc.) représentent, à l’heure actuelle, les familles de molécules biothérapeutiques les plus développées en clinique [ 1]. Plus de vingt molécules de ce type sont d’ores et déjà sur le marché (→) et le nombre d’essais cliniques en cours avec ces molécules représente environ 23 % des essais regroupant toutes les familles de molécules thérapeutiques confondues [ 2]. Les avancées scientifiques dans ce domaine ne se sont pas faites sans obstacles. En effet, les scientifiques ont été confrontés d’une part à des problèmes d’immunogénicité dus à la fois à la nature et à l’origine des molécules [ 3], d’autre part aux connaissances limitées sur l’impact de la qualité du produit fini, par exemple l’effet de l’agrégation [ 4]. Les avancées des techniques de génie génétique (utilisation d’anticorps murins, puis partiellement, voire totalement humanisés (→), ainsi qu’agonistes et antagonistes, etc.) [3] et des méthodes analytiques fines permettant une meilleure caractérisation de ces produits complexes ont permis d’améliorer la sécurité et l’efficacité des Acm en thérapeutique.

(→) voir A. Beck et al. Tableau I, page 1026

(→) voir M. Cogné et al., page 1149

La galénique a une grande importance dans le développement de produits biothérapeutiques dont les anticorps et leurs dérivés [ 5]. En effet, les principes actifs biologiques, par leur nature, sont très sensibles à leur environnement : celui-ci peut influencer leur activité, mais également et surtout la sécurité de leur utilisation en thérapeutique. Un des phénomènes souvent cités est que les biomédicaments, dans un état instable (voir plus loin), peuvent potentiellement être reconnus par l’organisme comme du « non-soi » et provoquer une réaction immunitaire aboutissant à la production d’anticorps neutralisants rendant ainsi le traitement inefficace [ 6].

Ainsi l’objectif du développement galénique est de maintenir l’intégrité chimique, physique et structurelle de l’anticorps. Et ce en sélectionnant l’environnement et les conditions de stockage, de transport et d’utilisation idéales qui conféreront à l’Acm une bonne stabilité tout au long de sa production et de sa commercialisation, et garantiront également son innocuité et son efficacité lors de son administration au patient.

La nature protéique des anticorps explique qu’ils soient sensibles à de nombreuses influences environnementales : température, lumière, pH extrême, agitation, cisaillement, cycles de congélation/décongélation, exposition à certains métaux et solvants organiques [5]. Ils peuvent ainsi subir plusieurs types de dégradation, d’origines physique et/ou chimique. Par ailleurs, les diverses étapes de la fabrication des Acm (par exemple les procédés de purification et de répartition) peuvent être sources de stress accélérant ces voies de dégradation [ 7]. L’altération physique ou chimique est alors suivie ou non d’un impact sur l’activité biologique et la sureté d’utilisation des anticorps.

Les dégradations physiques

La dénaturation Les Acm ont une structure tridimensionnelle indispensable à leur activité biologique. En effet, la structure tertiaire de l’anticorps se caractérise par un repliement spécifique des différentes zones : ceci permet soit leur exposition (par exemple, les complementary determining region (CDR) qui interviennent dans la liaison à l’antigène), soit leur confinement (par exemple, les motifs de glycosylation intervenant dans les activités effectrices de l’anticorps) (→). Ce repliement confère à la protéine une forme plus ou moins globulaire, maintenue par des interactions non covalentes entre les domaines. Lorsque l’anticorps possède cette structure dans son intégrité, on parle d’état natif. Sous certaines conditions (température, pH), la structure tertiaire devient vulnérable et le dépliement de l’anticorps se produit : il est alors dans un état dit dénaturé [ 8].

(→) voir R. Abès et al., page 1011 ; A. Beck et al., page 1024

Outre ses conséquences sur l’activité biologique de l’anticorps, la dénaturation est surtout responsable d’un phénomène lié et consécutif au dépliement de la molécule : l’agrégation.

Certains auteurs décrivent au cours du processus d’agrégation une étape transitoire de dénaturation partielle de l’anticorps qui serait propice à l’agrégation (Figure 1). À l’échelle moléculaire, on peut expliquer le phénomène par l’approche thermodynamique : celle-ci introduit la notion de niveau d’énergie que doit atteindre l’anticorps pour subir cet état transitoire. Une fois de plus, ce sont principalement les conditions environnementales (pH, nature du ou des cosolutés) qui influencent ces niveaux d’énergie [ 9].

Figure 1. Étapes de dénaturation de la protéine aboutissant à la formation d’agrégats solubles et même à la précipitation [9].

Figure 1. Étapes de dénaturation de la protéine aboutissant à la formation d’agrégats solubles et même à la précipitation [9].

L’agrégation L’agrégation est l’une des voies majeures de dégradation des protéines. Elle constitue la principale difficulté à maîtriser lors du développement galénique. En effet, on attribue à ces agrégats certaines réactions d’immunogénicité observées au cours d’essais cliniques de protéines thérapeutiques (→). Dans le cas des Acm, bien que l’immunogénicité induite par des agrégats soit rarement décrite dans la littérature, ce type de dégradation est néanmoins l’objet de toutes les attentions [ 10].

(→) voir P. Stas et I. Lasters, page 1070

Traditionnellement, on distingue les agrégats solubles, insolubles, réversibles et irréversibles [ 11]. La frontière entre la réversibilité et l’irréversibilité est ténue et dépend de paramètres divers : la force ionique, le pH ou le cisaillement que la protéine est amenée à subir durant certaines étapes du procédé de production.

À l’heure actuelle, les mécanismes de formation des agrégats ne sont pas complètement élucidés (pour revue voir [11]). Néanmoins, il est bien admis que le phénomène peut être initié soit par des interactions intermoléculaires entre des molécules d’anticorps intègres, soit par un contaminant dont on distingue deux origines principales :

• l’anticorps lui-même sous forme dénaturée (état natif altéré) : la dénaturation est rapportée comme la principale voie d’initiation de l’agrégation ;
• un contaminant, qui peut provenir par exemple du matériau de conditionnement (particule de silicate, silicone, etc.) [ 12].

Afin de remédier à la présence de particules visibles dans le produit fini (Figure 2), des filtres stériles (pores de diamètre 0,2 µm) sont souvent utilisés en ligne pendant l’administration du biomédicament. Cet aspect de la formulation constituera sans nul doute, dans les années à venir, un défi important pour les galénistes [12].

Figure 2. Illustration de solutions d’anticorps monoclonaux contenant (A) ou non (B) des particules protéiques visibles. (A) Formulation d’anticorps non optimisée. (B) Formulation stabilisée.

Figure 2. Illustration de solutions d’anticorps monoclonaux contenant (A) ou non (B) des particules protéiques visibles. (A) Formulation d’anticorps non optimisée. (B) Formulation stabilisée.

Au vu de la complexité et de la large taille des Acm comparés aux molécules chimiques pour lesquelles les outils de caractérisation sont plutôt ciblés, le développement de formulations appliquées à de telles protéines nécessite un large panel de techniques analytiques qui permettront la compréhension et la détection des nombreuses voies potentielles de dégradation.

À l’instar des dégradations physiques, les dégradations chimiques sont à prendre en compte dès le début du développement galénique de l’anticorps monoclonal. Parmi les étapes clés d’identification des sources potentielles d’altération chimique, l’analyse in silico de la séquence des chaînes lourdes et légères est un prérequis. En effet, on connaît la sensibilité de certaines séquences d’acides aminés et de leur environnement à certaines dégradations chimiques (voir pour exemple Tableau I). L’oxydation, la déamidation et l’hydrolyse sont parmi les voies de dégradation les plus fréquentes et par conséquent celles qui sont le plus suivies lors du développement de la formulation.

Tableau I. Séquences d’acides aminés assujetties à la déamidation.

Tableau I. Séquences d’acides aminés assujetties à la déamidation.

Oxydation

Certains acides aminés comme la méthionine et la cystéine, présents essentiellement dans le domaine Fc, sont sensibles à l’oxydation qui conduit notamment à la formation de résidus sulfoxides. D’autres acides aminés, l’histidine, le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine, sont également sensibles à l’oxydation mais à une moindre fréquence [5]. L’oxydation de résidus acides aminés n’entraîne pas toujours une perte d’activité ou une toxicité.

Les diverses voies de dégradation des anticorps précédemment décrites impliquent une adaptation du galéniste sur les plans technique (pour la fabrication) et analytique (pour la détection des anomalies), comme sur le plan physicochimique (pour le choix des excipients/stabilisants à incorporer dans la formulation) (Tableau II).

Tableau II. Voies de dégradation, méthodes analytiques associées et solutions galéniques potentielles. FT-IR : Fourier transform infrared spectroscopy ; WCX : weak cation-exchange column ; IEF : isoelectrofocusing

Tableau II. Voies de dégradation, méthodes analytiques associées et solutions galéniques potentielles. FT-IR : Fourier transform infrared spectroscopy ; WCX : weak cation-exchange column ; IEF : isoelectrofocusing

Tous les Acm disponibles sur le marché sont administrés par voie parentérale (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée). La forme pharmaceutique est ainsi soit une solution soit un lyophilisat. Les étapes majeures du développement galénique des Acm thérapeutiques sont les suivantes.

Contrairement aux petites molécules chimiques, il est quasiment impossible de prédire la durée de conservation d’un anticorps monoclonal sur la base d’études de stabilité accélérées à des températures élevées. En effet, à l’exception de certaines réactions d’hydrolyse, il est inapproprié d’extrapoler des cinétiques de dégradation telles que l’agrégation et l’oxydation à partir d’études de dégradation forcée. Ainsi la détermination de la date de péremption doit être basée sur des résultats réels de stabilité obtenus avec le produit sous sa présentation clinique ou commerciale finale (flacon ou seringue, volume de remplissage, température de stockage). Dans le cas de l’utilisation d’un dispositif d’injection, il est nécessaire de le considérer dans les études de stabilité. Toute autre étude, comme des études de stabilité accélérée (généralement réalisées à 25°C), ne servirait que de support à toute altération de la température survenant de façon imprévue lors de la fabrication, du transport ou du stockage. À l’heure actuelle, tous les anticorps, commerciaux ou en développement, liquides ou lyophilisats, sont stockés à 2-8 °C.

Le succès des Acm et de leurs dérivés a été possible grâce à deux paramètres : (1) les capacités de production à grande échelle et (2) le développement de formulations robustes leur conférant une bonne stabilité tout au long de la chaîne de fabrication, de transport, de stockage jusqu’à l’administration aux patients. Étant donné leur complexité et le nombre important de voies potentielles de dégradation, il est important de réaliser un large panel d’analyses et de caractérisations afin de s’assurer de leur stabilité. Généralement, la sélection de la formulation clinique ou commerciale résulte d’un compromis assurant le minimum de dégradation tout en privilégiant l’efficacité et la sécurité d’utilisation des produits.

Compte tenu de la pression actuelle pour diminuer les coûts des traitements, des concentrations de plus en plus fortes en anticorps thérapeutiques (> 100 mg/ml) seront nécessaires afin de permettre, à chaque fois que c’est envisageable, une administration du biomédicament par le patient lui-même par voie intramusculaire ou sous-cutanée. Le développement de telles formulations, généralement relativement visqueuses, est vu comme un défi [ 16] et se fera en parallèle avec celui de nouveaux dispositifs d’administration permettant leur administration aisée et ainsi mieux acceptés par les patients. D’autres approches sont envisagées : la formulation de nanosuspensions ou nanocristaux d’anticorps [ 17] ou même des formes solides [ 18]. Ceci ne se fera pas sans des avancées dans la compréhension des mécanismes de dégradation, surtout ceux impliqués dans les phénomènes d’agrégation susceptibles de provoquer des réactions immunogènes chez les patients [12].

Les auteurs déclarent avoir des liens durables ou permanents avec l’entreprise sanofi-aventis.