L’ovocyte fécondé est à l’origine du développement d’un organisme entier et représente à cet égard la cellule totipotente par excellence. Après quelques divisions cellulaires, au stade blastocyste, les cellules souches embryonnaires (ESC) de la masse cellulaire interne ont la capacité de donner naissance à tous les types cellulaires spécialisés, à l’exception des tissus extra-embryonnaires. Elles sont dites pluripotentes. Une sous-population de ces ESC donne naissance aux cellules germinales primordiales (PGC), qui sont des cellules souches germinales (GSC) seulement présentes pendant la vie fœtale. Chez les mâles, une deuxième population de GSC réside dans les gonades après la naissance, ce sont les cellules souches spermatogoniales (SSC) qui alimentent la voie de la spermatogenèse chez l’adulte. Les GSC ne sont pas totipotentes per se, mais perpétuent la totipotence de génération en génération : elles sont à l’origine de la production de gamètes qui, après fécondation, permettent la différenciation de tous les tissus sans exception dans l’individu en développement. Les dérivés in vitro des ESC, des PGC et des SSC sont respectivement les cellules ES, les cellules EG et les cellules GS (Figure 1). Ces modèles cellulaires conservent leur pluripotence, comme l’indique leur capacité à former les trois feuillets embryonnaires [ 1– 3]. L’efficacité de dérivation des EG et des GS est cependant limitée par la rareté et les difficultés d’identification et d’accès de leurs précurseurs biologiques. De plus, leur différenciation in vitro en gamètes matures et la manipulation de leur matériel génétique ne sont pas encore réalisées en routine [ 4]. Le développement d’un protocole de dérivation et de différenciation in vitro de cellules germinales à partir de cellules ES est une priorité.

Figure 1. Ontogénie des différents types de cellules souches embryonnaires et germinales in vivo et leurs dérivés in vitro. Au cours du développement embryonnaire, la masse cellulaire interne (ICM) (vert) du blastocyste est composée de cellules souches embryonnaires (ESC). Ces cellules peuvent êtres dérivées in vitro et sont appelées cellules ES. Au jour 6 de développement, les cellules germinales primordiales (PGC) (bleu) se développent au sein de l’épiblaste proximal dérivant de l’ICM. Après une phase de prolifération et de migration, les PGC colonisent les ébauches gonadiques vers J11,5. Chez les mâles, les PGC prolifèrent jusqu’à J15,5 où elles entrent en phase de quiescence (stade prospermatogonies). Les dérivés in vitro des PGC et des prospermatogonies présentes pendant la vie prénatale sont les cellules EG. Enfin, un autre type de cellules souches germinales réside dans les gonades après la naissance, ce sont les cellules souches spermatogoniales (SSC) qui alimentent la voie spermatogénétique chez l’adulte et à partir desquelles sont dérivées les cellules GS.

Figure 1. Ontogénie des différents types de cellules souches embryonnaires et germinales in vivo et leurs dérivés in vitro. Au cours du développement embryonnaire, la masse cellulaire interne (ICM) (vert) du blastocyste est composée de cellules souches embryonnaires (ESC). Ces cellules peuvent êtres dérivées in vitro et sont appelées cellules ES. Au jour 6 de développement, les cellules germinales primordiales (PGC) (bleu) se développent au sein de l’épiblaste proximal dérivant de l’ICM. Après une phase de prolifération et de migration, les PGC colonisent les ébauches gonadiques vers J11,5. Chez les mâles, les PGC prolifèrent jusqu’à J15,5 où elles entrent en phase de quiescence (stade prospermatogonies). Les dérivés in vitro des PGC et des prospermatogonies présentes pendant la vie prénatale sont les cellules EG. Enfin, un autre type de cellules souches germinales réside dans les gonades après la naissance, ce sont les cellules souches spermatogoniales (SSC) qui alimentent la voie spermatogénétique chez l’adulte et à partir desquelles sont dérivées les cellules GS.

Les ESC peuvent se spécialiser en PGC au cours du développement [ 5, 6]. Les cellules ES dérivées in vitro sont aussi capables de coloniser la lignée germinale in vivo après injection dans un blastocyste. Plusieurs laboratoires ont récemment réussi à imposer un destin germinal à des cellules ES dans une boîte de culture [ 7– 11]. Ces GSC dérivées de cellules ES peuvent être différenciées après culture en spermatides ou en ovocytes, suivant la composition chromosomique XY ou XX des cellules ES d’origine. Cependant, ces modèles cellulaires de différenciation germinale ne reproduisent pas les caractéristiques spatiales et temporelles du développement gamétique in vivo, et se pose légitimement la question de l’intégrité génétique et épigénétique des cellules germinales dérivées des cellules ES et de leur utilisation potentielle en médecine reproductive. Les contraintes d’environnement et de cinétique sont notamment cruciales pour la reprogrammation des profils de méthylation de l’ADN qui accompagnent la différenciation germinale mâle [ 12].

Le cycle spermatogénétique (de la SSC au spermatozoïde) requiert 35 jours chez la souris (Figure 4) [ 17]. La spermatogenèse implique une étape de multiplication des spermatogonies, une phase d’échange de matériel génétique et de réduction chromosomique dans les spermatocytes en méiose I et II, et une phase de maturation finale aboutissant à la formation des spermatides et enfin des spermatozoïdes. La progression de ces phases est-elle respectée en 10 jours ou 3 jours ? La phase de multiplication des spermatogonies consiste en un enchaînement de 6 divisions mitotiques (spermatogonies A1, A2, A3, A4, intermédiaires et B), aboutissant à une production de 64 cellules à partir d’une cellule SSC [14]. Aucune donnée n’est disponible quant au rendement des procédures de différenciation in vitro et il est donc difficile d’estimer si cette phase d’amplification est respectée. Le marqueur de prolifération des spermatogonies, c-kit, est bien exprimé après l’induction de la différenciation attestant de l’entrée des cellules dans le cycle spermatogénétique (Figure 2), mais cette expression coexiste avec l’expression de marqueurs spécifiques des phases suivantes de la spermatogenèse, méiotique et post-méiotique. Deux interprétations sont possibles : (1) la différenciation in vitro produit dès 3 jours une population hétérogène de cellules à différents stades de différenciation malgré une induction simultanée, ou (2) chacune de ces cellules exprime simultanément des marqueurs pré-méiotiques, méiotiques et post-méiotiques, traduisant un programme anarchique de différenciation sans respect de l’enchaînement séquentiel des différentes phases de la spermatogenèse.

Figure 4. Cycle de l’empreinte parentale au cours de la gamétogenèse mâle chez la souris. L’empreinte parentale est établie au cours de la gamétogenèse. Au moment de la fécondation, les spermatozoïdes sont porteurs d’une empreinte paternelle (bleu) et les ovocytes d’une empreinte maternelle (rouge). Les cellules germinales primordiales (PGC) émergent à J6,5 et sont retrouvées à la base de l’allantoïde à J8,5. À ce stade l’empreinte parentale est toujours de type biparentale somatique (bleu + rouge). Entre J8,5 et 11,5, les PGC migrent pour rejoindre les ébauches gonadiques. L’effacement de l’empreinte parentale s’effectue dans ces PGC post-migration à J12,5. Les PGC intégrés dans les ébauches gonadiques mâles prolifèrent jusqu’à J15,5 où elles entrent en phase de quiescence (stade prospermatogonies). À ce stade, l’empreinte paternelle (bleu) est établie par méthylation de l’ADN sous l’action de l’homologue d’ADN-méthyltransférase DNMT3L. A la naissance les prospermatogonies se différencient en SSC mitotiquement actives. Les SSC ont une capacité d’auto-renouvellement alimentant le pool de cellules souches, et de différenciation passant par divers intermédiaires (spermatogonies, spermatocytes et spermatides) pour produire des gamète haploïdes mâles matures (spermatozoïdes) porteurs d’une empreinte paternelle.

Figure 4. Cycle de l’empreinte parentale au cours de la gamétogenèse mâle chez la souris. L’empreinte parentale est établie au cours de la gamétogenèse. Au moment de la fécondation, les spermatozoïdes sont porteurs d’une empreinte paternelle (bleu) et les ovocytes d’une empreinte maternelle (rouge). Les cellules germinales primordiales (PGC) émergent à J6,5 et sont retrouvées à la base de l’allantoïde à J8,5. À ce stade l’empreinte parentale est toujours de type biparentale somatique (bleu + rouge). Entre J8,5 et 11,5, les PGC migrent pour rejoindre les ébauches gonadiques. L’effacement de l’empreinte parentale s’effectue dans ces PGC post-migration à J12,5. Les PGC intégrés dans les ébauches gonadiques mâles prolifèrent jusqu’à J15,5 où elles entrent en phase de quiescence (stade prospermatogonies). À ce stade, l’empreinte paternelle (bleu) est établie par méthylation de l’ADN sous l’action de l’homologue d’ADN-méthyltransférase DNMT3L. A la naissance les prospermatogonies se différencient en SSC mitotiquement actives. Les SSC ont une capacité d’auto-renouvellement alimentant le pool de cellules souches, et de différenciation passant par divers intermédiaires (spermatogonies, spermatocytes et spermatides) pour produire des gamète haploïdes mâles matures (spermatozoïdes) porteurs d’une empreinte paternelle.

La méiose pourrait être particulièrement sensible à cette compaction du temps de spermatogenèse, en raison de sa durée (10 jours), mais également des contrôles de qualité du matériel génétique qui opèrent pendant cette période. Un point de contrôle (check-point) très strict existe au stade pachytène de prophase de méiose I, contrôlant l’appariement de tous les autosomes homologues et induisant une réponse apoptotique en cas de non-conformité afin de prévenir la production de cellules avec un nombre aberrant de chromosomes [ 18]. Les spermatides dérivés de cellules ES ont bien un contenu d’ADN égal à 1n déterminé par cytométrie de flux, suggérant que la réduction méiotique a bien eu lieu. On ne peut cependant pas exclure des pertes ou des gains de 1 ou 2 chromosomes, attendus en cas d’un défaut d'activation du check-point. Les forts taux d’échec d’implantation des embryons dérivés des spermatides synthétiques et de mortalité prénatale pourraient refléter des aberrations de nombre des chromosomes portés par ces spermatides et transmises à la descendance.

La gamétogenèse n’est pas seulement responsable de la création d’un état de totipotence et de la mise en place de l’hérédité génétique. Elle permet également l’acquisition de marques de distinction parentale reconnues sous le terme d’empreinte génomique et qui déterminent le profil d’expression parent-spécifique d’une centaine de gènes avec des effets prépondérants sur le développement embryonnaire et post-natal [12, 19]. La mise en place de l’empreinte correspond à un marquage par méthylation de l’ADN des gènes soumis à empreinte paternelle et maternelle, respectivement dans les gamètes mâles et femelles. Cette fonction fait intervenir l’ADN méthyltransférase de novo DNMT3A, dont l’activité est stimulée par l’homologue d’ADN méthyltransférase DNMT3L [ 20]. DNMT3L est catalytiquement inactive mais orchestre la mise en place des profils de méthylation dans la lignée germinale [ 21– 23].

En ce qui concerne l’empreinte paternelle, les marques de méthylation sont acquises dans les prospermatogonies, cellules intermédiaires entre les PGC et les SSC, présentes dans les gonades mâles de 14,5 jours de développement à quelques jours après la naissance (Figure 4) [ 24]. Cette fenêtre précise coïncide avec l’expression spécifique de Dnmt3L au cours de la spermatogenèse, alors que Dnmt3A a un profil d’expression plus large [ 22, 25]. Les marques d’empreinte sont ensuite maintenues au cours des stades suivants de la spermatogenèse et après fécondation dans l’individu en développement. Les PGC pré-migratoires et en phase de migration ont une empreinte biparentale de type somatique, comme toutes les cellules de l’embryon. Ces marques doivent être effacées, afin de permettre le rétablissement de l’empreinte en fonction du sexe de l’individu [ 26, 27]. L’entrée dans les gonades déclenche aux alentours de 11,5 jours un effacement des marques de méthylation somatiques. L’environnement gonadique mâle détermine ensuite non seulement l’engagement des PGC vers un destin mitotique mâle, mais aussi l’acquisition subséquente de marques d’empreinte paternelle [ 28].

Dériver des GSC mâles matures à partir de cellules ES implique qu’il faille : (1) effacer les marques d’empreinte somatique des cellules ES, comme cela se produit in vivo dans les PGC qui colonisent les gonades, puis (2) établir un profil d’empreinte paternelle dans ces cellules au cours de leur différenciation in vitro. Les corps embryoïdes utilisés par les groupes de Daley et Noce reproduisent un environnement gonadique propice à la formation de GSC de type PGC [7, 9] et qui pourrait également stimuler la reprogrammation de l’empreinte dans ces cellules. Les profils de méthylation biparentaux sont effectivement effacés, à condition cependant que les cellules soient maintenues pendant une semaine à l’état indifférencié [9]. On ne sait pas si ces cellules acquièrent ensuite des marques de méthylation paternelles au cours de leur différenciation. Le groupe de Engel utilise une méthode de culture bidimensionnelle qui ne reproduit pas une architecture tissulaire analogue à des ébauches gonadiques et sélectionne de plus des GSC de type SSC [11]. Cela implique que les types cellulaires correspondant aux phases d’effacement (PGC) et d’acquisition (prospermatogonies) des marques de méthylation paternelles ont été court-circuités lors de cette dérivation. Les GSC de type SSC et les spermatides issus de leur différenciation montrent effectivement des aberrations de méthylation des gènes soumis à empreinte paternelle tels que H19, et soumis à empreinte maternelle tels que Snrpn et Igf2R. Les anomalies de méthylation semblent complètement aléatoires et ne permettent pas de discerner des défauts d’effacement des marques d’empreinte somatiques, d’établissement de l’empreinte paternelle ou d’acquisition illégitime d’empreinte maternelle dans les gamètes mâles dérivés in vitro. La dérivation de cellules type SSC plutôt que PGC n’est donc pas adéquate pour la reprogrammation de l’empreinte, et la différenciation in vitro n’est pas non plus suffisante pour stimuler des mécanismes de correction d’empreinte défectueuse. Une analyse du profil d’expression de DNMT3A et DNMT3L dans chacun des modèles permettrait de révéler si la machinerie d’acquisition de l’empreinte est bien présente et dans quel type cellulaire. Cette étude serait particulièrement informative pour DNMT3L, dont le profil d’expression spatial et temporel coïncide parfaitement avec la cinétique d’acquisition de l’empreinte dans la lignée germinale mâle et femelle [21, 22].

Des anomalies de méthylation des gènes soumis à empreinte sont retrouvées chez les animaux nés de l’injection ovocytaire intracytoplasmique de ces spermatides dérivés de cellules ES. Le phénotype de croissance et de létalité précoce des quelques animaux nés de cette procédure montre des similarités flagrantes avec les animaux issus de clonage par transfert de noyau somatique où des aberrations de méthylation et de régulation des gènes soumis à empreinte sont également documentées [ 29]. Le débat quant à l’utilisation potentielle de la technique de clonage à des fins thérapeutiques, et stimulé par ces anomalies d’empreinte [ 30], est finalement transférable à l’utilisation potentielle en médecine reproductive de gamètes issus de méthodes de dérivation et différenciation in vitro.