Le complexe NADPH oxydase se compose d’un élément protéique membranaire, le cytochrome b ₅₅₈ formé de deux sous-unités p22phox et gp91phox (phox vient de phagocyte oxidase, la gp91phox est encore appelée Nox2), et de facteurs cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox. Récemment, six homologues de gp91phox appartenant à la famille Nox-Duox ont été identifiés. Leur distribution tissulaire et leur régulation sont très différentes suggérant une grande variété de fonctions physiologiques. La modulation de leur activité peut entraîner des évènements physiopathologiques très divers [ 2].

Lorsque le neutrophile est au repos, le complexe NADPH oxydase est dissocié et inactif. Lors de la reconnaissance spécifique d’un élément pathogène par la cellule phagocytaire, une cascade de signalisation intracellulaire est déclenchée, aboutissant à la phosphorylation des facteurs cytosoliques. Ces éléments cytosoliques p47phox, p67phox et p40phox migrent ensuite vers la membrane plasmique où ils s’associent au cytochrome b ₅₅₈, formant un complexe NADPH oxydase actif. À partir de l’oxygène moléculaire (O₂), ce complexe est alors capable de produire des ions superoxyde

, point de départ de la synthèse de FRO bactéricides (Figure 1). Des petites protéines G, Rac1/2 et Rap1 ainsi que des protéines liant le calcium (MRP8 et MRP14) sont également impliquées dans la régulation de l’activité du complexe oxydase [2– 4].

La grosse sous unité du cytochrome b ₅₅₈ (gp91phox ou Nox2) est une glycoprotéine de 570 acides aminés et de masse moléculaire 91 kDa. C’est l’élément redox de l’oxydase. Le profil d’hydrophobicité de la protéine indique la présence de 6 hélices transmembranaires situées du côté amino-terminal comportant 3 sites extracellulaires de glycosylation [ 5]. Le modèle généralement admis comporte une séquence amino-terminale cytosolique, deux boucles B et D intracytoplasmiques et une queue cytosolique carboxy-terminale contenant les sites potentiels de fixation du FAD (flavine adénine dinucléotide) et du NADPH (Figure 2). Leur localisation a été déterminée par comparaison avec des séquences de flavoenzymes de la famille des ferrédoxines réductases (FNR) [ 6]. Le cytochrome b ₅₅₈ est porteur de deux hèmes liés à quatre histidines situées dans le troisième et le cinquième passage transmembranaire de gp91phox. L’existence d’un canal à protons, situé au niveau du troisième passage transmembranaire de gp91phox, permettrait la compensation de charge engendrée par le passage des électrons au travers de la membrane plasmique lors de l’activation du complexe oxydase. Cette théorie a été controversée ; gp91phox ne serait pas un canal à proton mais servirait à moduler d’autres canaux préexistants [ 7, 8].

Il existe deux formes de transmission de la CGD : l’une est liée à l’X (CGDX), c’est la forme la plus fréquente, l’autre est de type autosomique récessif (CGDAR) (Figure 3). Des mutations dans le gène CYBB codant gp91phox et localisé sur le bras court du chromosome X (Xp21.1), sont à l’origine de la CGDX. Il existe trois formes de CGDAR selon le gène affecté, NCF1, NCF2 ou CYBA codant respectivement les protéines p47phox, p67phox et p22phox. Hormis celle qui implique un défaut génique quasiment constant du gène NCF1 (une délétion GT au début de l’exon 2), ces formes sont très rares. Cela est probablement dû à des recombinaisons chromosomiques avec un pseudogène (ΨNCF1) contenant cette mutation, extrêmement homologue au gène NCF1 [ 9]. Généralement les mutations géniques n’ont pas de localisation spécifique (région promotrice des gènes, jonctions intron/exon, exons), et tous les types de mutations (délétions et/ou insertions de taille variable avec décalage du cadre de lecture, mutations ponctuelles non-sens, faux sens) peuvent être rencontrées [9– 11].

La plupart des mutations géniques conduisent à l’absence de la protéine correspondante, soit par un défaut de synthèse de l’ARN messager, soit par une instabilité de la protéine mutée (tronquée ou mal conformée) rapidement éliminée (CGDX⁰ ou CGDAR⁰). La forme dite CGDX⁰, la plus classique, se traduit par une absence des deux sous-unités du cytochrome b ₅₅₈, bien que seul le gène CYBB soit atteint. Il semblerait qu’il existe une stabilisation mutuelle de ces deux sous-unités, car dans les CGDAR avec une déficience en p22phox, gp91phox est également absente (Figure 3). L’expression clinique des CGD liées à l’X est généralement plus sévère que celle des formes de transmission autosomique récessive [1, 9].

Il existe des variants rares caractérisés soit par une sous expression (CGDX⁻), soit par une expression normale de gp91phox mutée (CGDX⁺). Les variants CGDX⁻ résultent de mutations faux-sens à l’origine d’une perte de la conformation stable de gp91phox ou plus rarement, de mutations dans le promoteur du gène CYBB [ 12]. Les mutations faux-sens dans la partie codante du gène sont principalement la cause des CGDX⁺. La rareté de ces formes variantes est illustrée par les résultats d’une étude récente répertoriant les différentes mutations à l’origine de CGDX publiées dans la littérature internationale. Sur 191 mutations, on dénombre 150 cas de CGDX⁰, 26 cas de CGDX⁻ et seulement 17 cas de CGDX⁺ [ 13].

La CGD, et plus particulièrement les formes X⁺, constitue un formidable modèle d’étude du complexe NADPH oxydase. L’étude de ces variants permet d’établir un lien direct entre une région et une fonction spécifique de la protéine gp91phox. Cela constitue une ouverture fascinante pour la compréhension des mécanismes d’activation et d’assemblage du complexe oxydase.

Les mutations à l’origine des CGDX⁺ sont principalement localisées dans la partie carboxy-terminale cytosolique de gp91phox (Figure 2). Cela suggère que cette séquence est impliquée majoritairement dans le fonctionnement de l’oxydase mais intervient peu dans la stabilisation de la structure protéique [ 14]. Sur les 18 mutations répertoriées dans la littérature, seules 8 ont fait l’objet d’une étude fonctionnelle. Des régions de gp91phox impliquées directement ou indirectement dans l’interaction des facteurs cytosoliques p47phox et/ou p67phox lors de l’assemblage du complexe oxydase, ont été découvertes grâce à l’étude des polynucléaires neutrophiles de patients atteints de CGDX⁺. La partie carboxy-terminale cytosolique de gp91phox semble particulièrement impliquée dans ce processus, puisque les mutations His303Asn/Pro304Arg, Cys369Arg, Gly408Glu, Asp500Gly et Glu568Lys inhibent la translocation des facteurs cytosoliques vers la membrane plasmique des neutrophiles des patients étudiés, après l’activation du complexe NADPH oxydase. De plus le transfert des électrons du NADPH vers le FAD est très souvent perturbé chez ces patients [ 15– 19]. L’étude du variant CGDX⁺ dû à la mutation Pro415His a permis de confirmer la localisation du site potentiel de fixation du NADPH et notamment le motif G-X-G-X-X-P essentiel à la liaison de la partie pyrophosphate du NADPH [6, 19]. Il est à noter que la mutation Gly408Glu située dans ce site, entraîne également l’inhibition de l’assemblage du complexe oxydase. Cela indique que la fixation du NADPH sur son site pourrait faciliter une conformation de gp91phox favorable à une interaction avec les facteurs cytosoliques p47phox et/ou p67phox. L’importance du site de fixation du FAD (³³⁸HPFT³⁴¹) dans le maintien d’une activité NADPH oxydase a également été soulignée par la découverte de la mutation Thr341Lys d’un mutant CGDX⁺ [ 18]. La mutation Arg54Ser de gp91phox, une des rares mutations localisée dans la partie membranaire de gp91phox, près de l’ancrage du premier hème, affecte les propriétés spectrales du cytochrome b ₅₅₈, ainsi que le passage des électrons du FAD vers les hèmes [15]. Cela confirme le modèle structural de gp91phox et conforte l’idée que les deux hèmes sont essentiels au passage électronique du FAD vers l’O₂ extracellulaire.

Bien que l’étude fonctionnelle des polynucléaires neutrophiles des patients CGDX⁺ apporte certaines informations structurales et fonctionnelles, la modélisation cellulaire des mutations humaines est nécessaire pour l’obtention d’un matériel biologique suffisamment abondant afin d’aborder la compréhension des mécanismes d’activation du complexe oxydase au niveau moléculaire.

Le modèle cellulaire le plus performant pour cette approche est sans doute la lignée promyélocytaire PLB-985 établie en 1987 par l’équipe du Pr Tom Rado à partir de cellules myéloïdes d’une patiente atteinte de leucémie aiguë [ 20]. La différenciation des cellules de cette lignée en polynucléaires neutrophiles est facilement induite. En 1993, l’équipe du Pr Mary Dinauer a établi une lignée PLB-985 dans laquelle le gène CYBB codant gp91phox a été inactivé par recombinaison homologue (PLB-985 KO)[ 21]. Il est donc possible, à partir de cette lignée, d’obtenir en culture des neutrophiles de type CGDX⁰. L’approche expérimentale consiste à reproduire les mutations humaines dans l’ADNc de gp91phox par mutagenèse dirigée. Après clonage de l’ADNc muté dans un vecteur d’expression eucaryote, celui-ci est transfecté de façon stable dans les cellules PLB-985 KO par électroporation. Après sélection des clones positifs, le suivi d’expression de la protéine gp91phox mutée se fait par immunodétection ou par cytométrie de flux à l’aide d’anticorps spécifiques.

En 1999, l’équipe du Pr M. Dinauer a réalisé la première étude fonctionnelle, dans la lignée PLB-985, d’une mutation humaine (délétion 488-497) à l’origine d’une CGDX⁺ [ 22, 23]. Cette mutation se situe dans une région particulièrement importante de la queue carboxy-terminale cytosolique de gp91phox (Thr483 à Gln507) (Figure 2), qui correspond à une boucle en hélice présente dans la séquence de tous les analogues Nox-Duox [2, 24]. Cette séquence pourrait intervenir dans le processus de régulation de l’assemblage du complexe oxydase tout en contrôlant l’accès du NADPH à son site de liaison (Figure 4). Au repos, l’hélice α recouvrirait le site de fixation du NADPH afin d’en interdire l’accès. Lors de l’activation de la NADPH oxydase, les facteurs cytosoliques s’associeraient avec gp91phox entraînant un changement conformationnel de cette protéine avec ouverture du site de fixation du NADPH par le glissement de l’hélice α à l’extérieur de ce site [ 25]. La délétion 488-497, bien qu’amputant une partie de l’hélice α ne semble pas empêcher la translocation des facteurs cytosoliques à la membrane plasmique lors de l’activation du complexe oxydase, mais elle inhibe le transfert d’électrons du NADPH vers le FAD. Cependant, les auteurs n’ont pas déterminé si le défaut d’activité oxydase associé à cette mutation était dû à une mauvaise conformation du cytochrome b ₅₅₈ et/ou à un défaut de fixation du NADPH à son site.

La boucle en hélice α de la partie cytosolique carboxy-terminale de gp91phox comporte des acides aminés chargés qui semblent jouer un rôle décisif dans les processus d’assemblage et d’activation du complexe oxydase. La mutation Asp500Gly, dont l’impact fonctionnel a été préalablement étudié à partir des neutrophiles d’un patient atteint de CGDX⁺ [ 17], a été reproduite dans le modèle PLB-985, permettant ainsi de démontrer l’importance de la charge négative de cet acide aminé. En effet, l’annulation ou la réversion de sa charge négative (Asp500Gly, Asp500Ala, Asp500Arg) a un effet drastique sur l’activité NADPH oxydase ainsi que sur la translocation des facteurs cytosoliques [ 26]. Un effet identique est obtenu par l’annulation ou l’inversion de la charge d’autres acides aminés chargés localisés dans cette hélice α cytosolique (Asp484Thr His490Asp) (Figure 4).

La mutation Leu505Arg de gp91phox, caractéristique d’un cas de CGDX⁺ récemment diagnostiqué au laboratoire (Figure s 2 et 4), a été également modélisée dans les cellules PLB-985 [11, 27]. Cette leucine est totalement conservée dans les protéines Nox-Duox, suggérant un rôle fonctionnel commun dans cette famille. Le cytochrome b ₅₅₈ recombinant muté a été purifié afin d’étudier les mécanismes moléculaires d’assemblage du complexe oxydase in vitro, en présence des protéines p47phox, p67phox et Rac1 recombinantes. La mutation Leu505Arg influence l’interaction de p67phox avec le cytochrome b ₅₅₈. Des concentrations trois fois plus importantes de p67phox sont nécessaires pour l’activation maximum du turn-over du cytochrome b ₅₅₈ muté. De plus, l’affinité du cytochrome b ₅₅₈ muté purifié pour le NADPH est trois fois plus importante que celle du cytochrome b ₅₅₈ sauvage. Cela indique que la liaison du NADPH à son site est probablement étroitement liée à l’interaction du cytochrome b ₅₅₈ avec p67phox. La mutation Leu505Arg pourrait perturber les mouvements de l’hélice α et sa liaison avec p67phox, empêchant une accessibilité optimale du NADPH au niveau de son site de fixation. Il faut noter que par comparaison avec les séquences des membres de la famille FNR, la Leu505 fait partie du site potentiel de fixation de l’adénine du NADPH [25]. Cependant la plupart des FNR (ferredoxine-NADP⁺ réductase ne possèdent pas l’hélice α cytosolique dont l’insertion semble détruire la structure de cette partie du site de liaison du NADPH [ 28, 29].

Enfin le modèle cellulaire PLB-985 KO a également permis d’étudier l’impact d’une double mutation His303Asn/Pro304Arg sur l’activité NADPH oxydase des neutrophiles d’un patient atteint de CGDX⁺ [ 16]. Chaque mutation, His303Asn et Pro304Arg, ainsi que la double mutation, ont été reproduites et étudiées dans le modèle PLB-985 KO. Ce travail a permis d’exclure la possibilité que l’une des mutations soit un polymorphisme du gène CYBB, car chacune séparément entraîne un défaut d’assemblage du complexe oxydase à l’origine de l’inhibition de son activité [ 30].

Il semble donc que la modélisation cellulaire de mutations humaines à l’origine de CGD X⁺ permette d’aborder les mécanismes moléculaires d’activation du complexe oxydase des phagocytes.