Les cellules souches embryonnaires murines ES sont isolées directement en culture à partir de la masse cellulaire interne (ICM) d’embryons âgés de 3,5 jours (blastocystes) [ 1, 2]. Elles sont pluripotentes et capables de se différencier in vivo dans tous les organes de l’embryon et, in vitro, dans la plupart des types cellulaires, à l’exception des tissus extra-embryonnaires. Les résultats actuellement disponibles indiquent que les cellules ES se différencient en suivant un programme génétique comparable (en termes de molécules, voies de signalisation, étapes et chronologie) à celui des cellules souches neurales au cours du développement embryonnaire. Expérimentalement, les cellules ES possèdent un potentiel dans les domaines de la thérapie cardiaque, pulmonaire, hépatique ou encore de la régénération osseuse et articulaire [ 3], mais c’est dans le traitement des maladies cérébrales dégénératives que la technique ouvre ses perspectives les plus intéressantes [ 4, 5]. Dans cet article, nous nous focaliserons sur la différenciation neurale des cellules souches embryonnaires murines ES, en suivant l’idée selon laquelle les cellules ES se différencient in vitro selon un programme génétique similaire à celui qui régit le développement embryonnaire in utero.

Deux méthodes principales sont utilisées pour différencier les cellules ES en cellules neurales. La première fait appel à la formation des corps embryoïdes, qui développent les trois feuillets germinatifs. Ils représentent un succédané, in vitro, des embryons au stade péri-implantatoire : les cellules produisent une population mixte contenant en proportion variable des neurones et des cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes). La seconde méthode consiste à cultiver les cellules ES en milieu sans sérum, conditionné ou non par différents morphogènes : les cellules ES produisent alors des populations quasi homogènes de neurones ou de cellules gliales. L’ensemble des résultats montrent que les cellules ES, in vitro, produisent et répondent aux différents signaux responsables de la différenciation neurale de l’embryon (Figure 1).

Figure 1. Différenciation des cellules ES en cellules neurales. Deux types de techniques de culture avec ou sans sérum permettent d’obtenir des cellules neurales à partir de cellules ES. En milieu avec sérum, les cellules se différencient en corps embryoïdes. Le milieu est conditionné soit par l’acide rétinoïque (AR) [ 26, 50], soit par le milieu ITSFn (contenant insuline, transferrine, sélénium et fibronectine) [4]. Deux neuropeptides, le VIP et le PACAP, induisent la différenciation des ES dans les corps embryoïdes [ 51]. En milieu sans sérum, les cellules ES sont cultivées en monocouche [ 25] ou en coculture sur des cellules stromales. Les cellules PA6 produisent à leur surface cellulaire le SDIA, un principe actif qui induit la différenciation neurale des cellules [ 52]. La coculture en présence d’astrocytes (ACM) induit également la neuralisation [ 11]. Les facteurs EGF et FGF2 favorisent la prolifération des précurseurs neuraux issus des cellules ES. Le PDGF permet, quant à lui, d’achever la différenciation gliale.

Figure 1. Différenciation des cellules ES en cellules neurales. Deux types de techniques de culture avec ou sans sérum permettent d’obtenir des cellules neurales à partir de cellules ES. En milieu avec sérum, les cellules se différencient en corps embryoïdes. Le milieu est conditionné soit par l’acide rétinoïque (AR) [ 26, 50], soit par le milieu ITSFn (contenant insuline, transferrine, sélénium et fibronectine) [4]. Deux neuropeptides, le VIP et le PACAP, induisent la différenciation des ES dans les corps embryoïdes [ 51]. En milieu sans sérum, les cellules ES sont cultivées en monocouche [ 25] ou en coculture sur des cellules stromales. Les cellules PA6 produisent à leur surface cellulaire le SDIA, un principe actif qui induit la différenciation neurale des cellules [ 52]. La coculture en présence d’astrocytes (ACM) induit également la neuralisation [ 11]. Les facteurs EGF et FGF2 favorisent la prolifération des précurseurs neuraux issus des cellules ES. Le PDGF permet, quant à lui, d’achever la différenciation gliale.

Les cellules ES, toutes premières cellules souches de l’embryon, sont capables de s’autorenouveler, c’est-à-dire de se reproduire à l’infini sans perdre leur potentialité. Ce phénomène nécessite l’activation de la voie STAT et des facteurs de transcription NANOG et OCT (Figure 2).

Figure 2. Pluripotentialité des cellules ES et induction de leur différenciation en cellulesdu neurectoderme. La prolifération des cellules ES est assurée par le facteur soluble LIF, au travers de l’activation de STAT3. De son côté, BMP active SMAD, qui inactive STAT3. NANOG intervient quant à lui en activant la prolifération des cellules ES et en inhibant leur différenciation. L’inactivation de STAT3, en l’absence de LIF, induit la différenciation des cellules ES en cellules de l’ectoderme primitif. En parallèle, OCT4, à une concentration basale, stimule l’autorenouvellement. Son absence entraîne en revanche la différenciation des cellules ES en trophectoderme ; à l’inverse, des doses élevées d’OCT4 induisent la différenciation des cellules ES en cellules de l’ectoderme primitif. L’inhibition de BMP4, grâce aux inhibiteurs naturels tels que Noggin et Chordin, induit la spécification neurale par défaut, au détriment de la différenciation épidermique. L’acide rétinoïque (AR) active la différenciation des cellules de l’ectoderme en neurectoderme au travers de deux mécanismes, l’un direct, l’autre via l’inhibition de la voie de signalisation Wnt/β-caténine. Par ailleurs, l’acide rétinoïque inhibe aussi la voie de signalisation des FGF, connue pour sa régulation négative de la voie Wnt.

Figure 2. Pluripotentialité des cellules ES et induction de leur différenciation en cellulesdu neurectoderme. La prolifération des cellules ES est assurée par le facteur soluble LIF, au travers de l’activation de STAT3. De son côté, BMP active SMAD, qui inactive STAT3. NANOG intervient quant à lui en activant la prolifération des cellules ES et en inhibant leur différenciation. L’inactivation de STAT3, en l’absence de LIF, induit la différenciation des cellules ES en cellules de l’ectoderme primitif. En parallèle, OCT4, à une concentration basale, stimule l’autorenouvellement. Son absence entraîne en revanche la différenciation des cellules ES en trophectoderme ; à l’inverse, des doses élevées d’OCT4 induisent la différenciation des cellules ES en cellules de l’ectoderme primitif. L’inhibition de BMP4, grâce aux inhibiteurs naturels tels que Noggin et Chordin, induit la spécification neurale par défaut, au détriment de la différenciation épidermique. L’acide rétinoïque (AR) active la différenciation des cellules de l’ectoderme en neurectoderme au travers de deux mécanismes, l’un direct, l’autre via l’inhibition de la voie de signalisation Wnt/β-caténine. Par ailleurs, l’acide rétinoïque inhibe aussi la voie de signalisation des FGF, connue pour sa régulation négative de la voie Wnt.

La voie de transduction STAT, activée par l’interaction de différents signaux extracellulaires (IL-6 et LIF, par exemple) avec un récepteur commun (Gp130), conduit à l’activation du cycle cellulaire et au maintien de l’état indifférencié. Chez l’embryon, l’inactivation génique de stat3 ou de gp130 est létale au stade E6 (précoce) de développement [ 6, 7], confirmant le rôle prépondérant de la voie STAT3 dans le développement embryonnaire. En revanche, les souris invalidées pour le gène codant pour le facteur LIF sont viables [ 8], ce qui suggère que d’autres facteurs endogènes régulent la voie STAT3 in vivo. In vitro, l’activation de STAT3 par LIF est suffisante pour assurer l’autorenouvellement des cellules ES ; à l’inverse, en l’absence de LIF pour activer la voie STAT3, les cellules ES se différencient spontanément [6, 9, 10]. De même, l’expression ectopique d’un mutant dominant négatif de STAT3 déclenche la différenciation cellulaire. Cependant, lorsque les cellules ES sont établies en milieu sans sérum (avec les suppléments N2 et B27 qui conditionnent le milieu de culture des cellules neuronales), des voies alternatives à LIF/STAT3 sont requises pour induire l’autorenouvellement des cellules ES, et plus particulièrement pour inhiber la différenciation neurale [11] (Figure 2). LIF seul augmente le nombre de cellules ES non différenciées. La combinaison de LIF avec BMP4 ou BMP2 (bone morphogenic proteins) augmente le taux d’autorenouvellement des cellules ES non différenciées [11]. La combinaison de LIF et BMP permet de maintenir le potentiel de différenciation : leur carence entraîne la différenciation neurale. Cependant, l’effet de la voie BMP/SMAD sur l’autorenouvellement reste assujetti à l’état d’activation de la voie de signalisation de LIF.

Par ailleurs, deux facteurs de transcription à homéodomaine, NANOG et OCT4, semblent étroitement contrôler l’autorenouvellement et/ou la différenciation des cellules souches [11– 13]. NANOG et OCT4 sont exprimés dans la masse cellulaire interne (ICM) et les cellules épiblastiques des embryons préimplantés, et disparaissent au cours du développement précoce (gastrulation).

La délétion partielle de nanog, qui provoque une réduction d’environ 50 % du taux de NANOG produit dans les cellules ES invalidées, se traduit par une différenciation multidirectionnelle soutenue [ 14]. À l’inverse, la surexpression de NANOG permet aux cellules ES de s’autorenouveler en l’absence de LIF et de BMP [11]. NANOG est exprimé dans les embryons oct4^−/−, suggérant qu’OCT4 et lui-même suivent des voies différentes [ 15].

OCT4 est exprimé tout d’abord dans l’ovocyte ; son expression décline ensuite pendant les premiers clivages, puis réapparaît au stade 4-8 cellules. Il est confiné à l’ICM et à l’épiblaste, pour disparaître quand la différenciation apparaît, mais son expression persiste dans les cellules germinales (pluripotentes et/ou totipotentes) [11–13, 15]. Chez l’embryon de souris, l’invalidation permanente du gène oct4 empêche l’établissement de populations cellulaires pluripotentes et provoque l’arrêt du développement [13]. In vitro, selon son degré d’expression, Oct4 gouverne trois destins différents des cellules ES : le taux normal d’expression est requis pour maintenir l’autorenouvellement des cellules ES ; son augmentation favorise la formation de l’ectoderme primitif [15], puis de l’ectoderme en endoderme définitif et mésoderme ; au contraire, la répression de OCT 4 induit la perte de la pluripotentialité et la dédifférenciation en trophectoderme.

La différenciation de l’ectoderme primitif en neurectoderme est à l’origine de la différenciation neurale. Les cellules sont alors orientées vers un destin neural par l’action centrale des BMP. Cette étape est un préalable à l’acquisition par les précurseurs neuraux de l’identité rostrocaudale, puis dorsoventrale. Malgré l’absence de structure tridimensionnelle, les résultats expérimentaux démontrent que la différenciation des cellules ES en culture dépend des mêmes stimulus morphogènes que ceux identifiés dans la mise en place des territoires nerveux embryonnaires in vivo.

BMP et SHH s’opposent pour produire, à partir des cellules souches, les populations neuronales qui déterminent l’axe dorsoventral de l’embryon. L’axe dorsoventral est spécifié essentiellement par les actions antagonistes de BMP4 et SHH. Les facteurs EGF, FGF8 et FGF2, ainsi que l’AR sont également requis. Les voies de signalisation de l’AR et du FGF interagissent dans la régulation de la spécification de l’axe rostrocaudal : l’inhibition de la voie de signalisation du FGF supprime ainsi l’expression du récepteur de l’AR (RAR). À l’inverse, la surexpression du récepteur RARα restaure les effets du FGF, ce qui suggère que le récepteur de l’AR, RARα2, est bien une cible directe de la voie de signalisation du FGF [ 32].

BMP4 et dorsalisation des cellules proneurales

Les cellules proneurales issues des cellules ES se différencient en précurseurs des motoneurones et cellules de la crête neurale par l’action de BMP4. Dans l’embryon, le facteur BMP4 est sécrété par le plafond du tube neural. Il diffuse selon un gradient le long du tube neural pour agir différentiellement, selon la dose et la position, sur l’identité dorsale des précurseurs neuronaux. Ces précurseurs se différencient séquentiellement en neurones, puis en précurseurs des cellules de la crête neurale [ 33]. L’action de BMP4, en fin de gastrulation, sur les cellules proneurales issues des cellules ES cultivées en milieu défini conduit à l’acquisition progressive des caractères propres aux neurones dorsaux et aux cellules de la crête neurale [30]. Ainsi, la présence de BMP4 augmente le nombre de cellules exprimant les marqueurs de la crête neurale (snail, slug, Msx1) au détriment des marqueurs ventraux (Nkx2.2 et HNF3β). De plus, BMP4 induit, à partir des précurseurs de la crête neurale, la différenciation de neurones sensoriels (Brn3a/Peri) ou, pour une dose plus élevée, de neurones autonomes (TH/Peri). Ces résultats montrent, de nouveau, que BMP4 induit la différenciation des cellules ES suivant un processus similaire à celui observé chez l’embryon (Figure 3).

Figure 3. Différenciation des cellules proneurales issues des cellules ES dans les différents types de cellules neurales. L’action opposée de SHH et BMP4 sur les cellules proneurales conduit à la production de cellules précurseurs du plancher et de cellules de la crête neurale. Les marqueurs spécifiques des différents types cellulaires sont en italiques. Les types de neurones sont placés selon le gradient de concentration qui permet l’acquisition de leur identité. La localisation embryonnaire correspondant à l’identité acquise par les cellules issues des cellules ES est indiquée sous les différents neurones. Le schéma montre que la différenciation des cellules ES en neurones reproduit la différenciation spatiotemporelle obtenue au cours du développement embryonnaire in vivo. Les facteurs de différenciation sélective (FGF, BDNF, NT4, PDGF, CNTF et AR) sont indiqués dans les bulles jaunes.

Figure 3. Différenciation des cellules proneurales issues des cellules ES dans les différents types de cellules neurales. L’action opposée de SHH et BMP4 sur les cellules proneurales conduit à la production de cellules précurseurs du plancher et de cellules de la crête neurale. Les marqueurs spécifiques des différents types cellulaires sont en italiques. Les types de neurones sont placés selon le gradient de concentration qui permet l’acquisition de leur identité. La localisation embryonnaire correspondant à l’identité acquise par les cellules issues des cellules ES est indiquée sous les différents neurones. Le schéma montre que la différenciation des cellules ES en neurones reproduit la différenciation spatiotemporelle obtenue au cours du développement embryonnaire in vivo. Les facteurs de différenciation sélective (FGF, BDNF, NT4, PDGF, CNTF et AR) sont indiqués dans les bulles jaunes.

Dans l’embryon, la différenciation gliale apparaît après la différenciation neuronale dans les zones ventrales et dorsales du tube neural. Elle est directement contrôlée par SHH et implique l’expression des facteurs de transcription Olig2 et Nkx2.2 ; cependant, une voie alterne indépendante de SHH existe vraisemblablement [ 40]. Olig2 est initialement exprimé dans les progéniteurs oligodendrocytaires ventraux et, inversement, réprimé dans les neurones et les astrocytes. La différenciation oligodendrocytaire est en effet réduite et retardée chez les souris n’exprimant plus ce facteur de transcription. Par ailleurs, les progéniteurs exprimant Olig2 sont capables de myéliniser des axones en culture et, in vivo, dans la moelle épinière endommagée [ 41, 42]. L’expression du marqueur Nkx2.2 participe à la spécification oligodendrocytaire, puisque l’apparition d’oligodendrocytes matures est fortement réduite sur l’ensemble de l’axe rostrocaudal chez les animaux mutants dénués de Nkx2.2, tandis que la population astrocytaire reste inchangée. La différenciation astrocytaire apparaît également au niveau dorsal du tube neural sous l’influence de BMP4. À ce niveau, les progéniteurs semblent incapables de donner naissance à des populations oligodendrocytaires, suggérant une origine distincte de celle des progéniteurs oligo-astrocytaires ventraux.

Dans certaines conditions de culture, les cellules ES se différencient en cellules gliales [41, 43]. Les corps embryoïdes peuvent produire des cellules astrogliales, oligodendrogliales et microgliales (visualisées respectivement par les marqueurs GFAP, O4 et 5C6 ou galectin-3) selon un processus séquentiel qui rappelle la dynamique des mécanismes mis en jeu in utero [ 44]. Ainsi, les cellules ES surexprimant de façon constitutive Olig2 produisent des oligodendrocytes et des motoneurones [ 45]. Enfin, l’ajout de FGF2 sur les corps embryoïdes induit la co-expression d’Olig2 et du récepteur du PDGF dans 12 % des cellules ; cette proportion de cellules doublement marquées passe à 85 % en 48 heures lorsque SHH et FGF sont tous deux ajoutés, confirmant l’action conjointe de SHH et FGF dans la genèse oligodendrocytaire. Enfin, l’action séquentielle et temporelle de ces facteurs en culture a été démontrée pour l’obtention en nombre d’astrocytes ou d’oligodendrocytes [36] (Figure 3).

L’ensemble des travaux présentés dans cet article démontrent que la différenciation neurale des cellules ES en culture se déroule selon un programme génétique similaire à celui observé chez l’embryon. En l’absence d’une structure tridimensionnelle, les cellules ES sont a priori capables de donner naissance non seulement à toutes les populations neuronales (motrices, sensorielles et associatives) produites in vivo chez la souris, mais aussi aux lignées oligo-astrogliales. La culture des cellules ES en présence de signaux extracellulaires, identifiés comme morphogéniques chez l’embryon, activent des programmes de spécification et d’identité de position selon un programme spatiotemporel similaire à celui mis en place dans l’embryon. Dans ce contexte, l’utilisation des cellules souches ES natives ou prédifférenciées dans le traitement de modèles animaux des maladies neurodégénératives humaines apparaît comme une avancée décisive. Ainsi, de nombreux travaux récents rapportent l’implantation réussie de cellules souches dans le cerveau de souris présentant des conditions pathologiques reproduisant certains troubles neurologiques observés chez l’homme [29].