La transmission fidèle du patrimoine génétique exige la coordination d’un réseau de voies métaboliques comprenant le contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose et la réparation de l’ADN. Cet équilibre permet d’éviter la prolifération de cellules dont l’ADN est endommagé, qui pourrait conduire à des transformations malignes. Le gène suppresseur de tumeurs p53 est le gène le plus fréquemment muté dans les cancers. En réponse à un stress génotoxique, la protéine p53 active l’expression d’une série de gènes de contrôle du cycle cellulaire et de l’apoptose [ 1]. Cette activité de transactivateur transcriptionel est généralement considérée comme l’activité canonique onco-suppressive de p53. Cependant, depuis quelques années, différents laboratoires ont mis en évidence un rôle additionnel de p53 dans le contrôle de la plasticité du génome, la régulation de la recombinaison homologue, indépendante de son activité de transactivation. La protéine p53 agit directement sur la recombinaison homologue grâce à des interactions physiques avec les protéines et les structures d’ADN intermédiaires de recombinaison homologue.

La recombinaison homologue est un processus fondamental conservé dans tous les organismes et impliqué dans le contrôle de la plasticité du génome (→). Le modèle le plus étayé est celui de la réparation d’une cassure double brin (CDB) (Figure 1).

(→) m/s 1990, n° 1, p. 18

Figure 1. Modèle de réparation des cassures double brin (CDB) par recombinaison homomogue. 1. La CDB est métabolisée par une exonucléase qui produit des queues simple brin. 2. L’ADN simple brin envahit un ADN duplexe homologue intact. Cette étape requiert des séquences homologues, mais un polymorphisme limité est toléré par le processus : un échange de brin entre deux séquences non parfaitement homologues crée une molécule hybride porteuse de mésappariements de base, appelée hétéroduplexe, qui peut être prise en charge par le système de réparation des mésappariements de bases. Cette étape produit également des jonctions cruciformes (jonctions de Holliday) qui peuvent migrer (migration de branche), permettant ainsi l’élongation de la molécule hétéroduplexe. Cette étape initiale d’appariement, puis d’échange de brins, est catalysée par les protéines RecA chez la bactérie et Rad51 chez les eucaryotes. 3. Une polymérisation est déclenchée en utilisant l’extrémité 3’ du brin envahisseur comme amorce. Le brin d’ADN intact déplacé par la synthèse s’hybride alors avec la queue simple brin complémentaire, l’étape étant réalisée grâce à la protéine Rad54. Les cercles en pointillés indiquent les zones où la protéine p53 peut interagir directement avec l’intermédiaire de recombinaison homomogue. 4. Les brèches simple brin sont comblées par la polymérisation. 5. La conversion génique (transfert non réciproque d’information génétique ne modifiant pas la structure générale du chromosome) dépend de l’orientation de la réparation des mésappariements et de la séquence copiée dans la région de la CDB. Les jonctions de Holliday peuvent être résolues selon deux orientations alternatives (triangles noir ou blanc) : suivant l’orientation de résolution, les produits (conversion génique) seront associés on non à un crossing-over (échange réciproque d’information génétique) (d’après [ 38]).

Figure 1. Modèle de réparation des cassures double brin (CDB) par recombinaison homomogue. 1. La CDB est métabolisée par une exonucléase qui produit des queues simple brin. 2. L’ADN simple brin envahit un ADN duplexe homologue intact. Cette étape requiert des séquences homologues, mais un polymorphisme limité est toléré par le processus : un échange de brin entre deux séquences non parfaitement homologues crée une molécule hybride porteuse de mésappariements de base, appelée hétéroduplexe, qui peut être prise en charge par le système de réparation des mésappariements de bases. Cette étape produit également des jonctions cruciformes (jonctions de Holliday) qui peuvent migrer (migration de branche), permettant ainsi l’élongation de la molécule hétéroduplexe. Cette étape initiale d’appariement, puis d’échange de brins, est catalysée par les protéines RecA chez la bactérie et Rad51 chez les eucaryotes. 3. Une polymérisation est déclenchée en utilisant l’extrémité 3’ du brin envahisseur comme amorce. Le brin d’ADN intact déplacé par la synthèse s’hybride alors avec la queue simple brin complémentaire, l’étape étant réalisée grâce à la protéine Rad54. Les cercles en pointillés indiquent les zones où la protéine p53 peut interagir directement avec l’intermédiaire de recombinaison homomogue. 4. Les brèches simple brin sont comblées par la polymérisation. 5. La conversion génique (transfert non réciproque d’information génétique ne modifiant pas la structure générale du chromosome) dépend de l’orientation de la réparation des mésappariements et de la séquence copiée dans la région de la CDB. Les jonctions de Holliday peuvent être résolues selon deux orientations alternatives (triangles noir ou blanc) : suivant l’orientation de résolution, les produits (conversion génique) seront associés on non à un crossing-over (échange réciproque d’information génétique) (d’après [ 38]).

La recombinaison homologue est considérée comme un système de réparation fidèle, car elle copie une séquence homologue intacte, ce qui lui permet d’assurer la stabilité du génome (réparation de l’ADN, redémarrage des fourches de réplication bloquées, ségrégation des chromosomes). Toutefois, l’échange entre séquences d’ADN homologues, mais non identiques, permet aussi à la recombinaison homologue de produire de la variabilité génétique (évolution moléculaire, diversification d’antigènes membranaires, genèse du répertoire immunitaire chez le poulet ou le lapin, brassage des allèles en méiose). Un excès de recombinaison homologue peut cependant devenir délétère et conduire à des réarrangements chromosomiques, à des pertes d’hétérozygotie ou à des inactivations de gènes (Figure 2), toutes situations observées dans différentes maladies [ 2, 3]. Un contrôle précis de la recombinaison homologue est donc indispensable afin d’éviter une trop grande instabilité génétique. La protéine p53 participe directement à ce contrôle grâce à des interactions directes avec les protéines de recombinaison homologue (Rad51 et Rad54), ainsi qu’avec ses intermédiaires (hétéroduplexes et jonctions de Holliday).

Figure 2. Instabilité génétique associée à un excès de recombinaison homomogue. A. Réarrangements chromosomiques résultant de crossing-over [ 39]. 1. Crossing-over inter-chromosomique ou entre chromatides sœurs décalées aboutissant à une amplification et à une délétion génique. 2. Crossing-over intrachromatidien entre séquence en répétition directe aboutissant à l’excision du fragment interne. 3. Crossing-over entre répétition en orientation inverse aboutissant à l’inversion du fragment interne. 4-5. Crossing-over interchromosomiques : selon l’orientation par rapport au centromère, les produits seront une translocation (4) ou un chromosome dicentrique et un chromosome acentrique (5). B. Conversion génique entre (1) deux hétéro-allèles aboutissant à une perte d’hétérozygotie ou entre (2) un pseudogène (flèche jaune) et un gène (flèche bleue), aboutissant à l’inactivation du gène. Les mutations transférées sont représentées par le trait rouge.

Figure 2. Instabilité génétique associée à un excès de recombinaison homomogue. A. Réarrangements chromosomiques résultant de crossing-over [ 39]. 1. Crossing-over inter-chromosomique ou entre chromatides sœurs décalées aboutissant à une amplification et à une délétion génique. 2. Crossing-over intrachromatidien entre séquence en répétition directe aboutissant à l’excision du fragment interne. 3. Crossing-over entre répétition en orientation inverse aboutissant à l’inversion du fragment interne. 4-5. Crossing-over interchromosomiques : selon l’orientation par rapport au centromère, les produits seront une translocation (4) ou un chromosome dicentrique et un chromosome acentrique (5). B. Conversion génique entre (1) deux hétéro-allèles aboutissant à une perte d’hétérozygotie ou entre (2) un pseudogène (flèche jaune) et un gène (flèche bleue), aboutissant à l’inactivation du gène. Les mutations transférées sont représentées par le trait rouge.

L’impact de p53 sur la recombinaison homologue a été étudié dans diverses lignées cellulaires. L’inactivation de p53 a été réalisée par des stratégies distinctes comprenant la délétion du gène p53, l’inactivation de la protéine p53 (mutation thermosensible, protéine antagoniste) ou l’expression d’un mutant dominant négatif. La recombinaison homologue a été mesurée dans ces modèles par l’analyse de la recombinaison homologue intermoléculaire entre deux génomes de virus SV40 défectueux [ 4], ou par l’étude de la recombinaison homologue intramoléculaire entre deux séquences répétées en tandem, intégrées dans le génome cellulaire [ 5– 11]. Ces conclusions ont été récemment confirmées in vivo dans un modèle murin transgénique [4].

Le niveau d’expression de p53 est important pour la répression de la recombinaison homologue. Des cellules homozygotes ou hétérozygotes pour l’invalidation de p53 ont une haplo-insuffisance pour l’inhibition de la recombinaison homologue [ 10]. De plus, si une faible expression de p53 normale peut inhiber la recombinaison homologue [14], inversement, de faibles niveaux d’expression de p53 mutante à effet dominant négatif sont capables de stimuler la recombinaison homologue [11]. La protéine p53 possède un domaine central ainsi qu’un domaine d’oligomérisation, tous deux nécessaires à la répression de la recombinaison homologue [11, 20] (Figure 3A). En revanche, le domaine carboxyterminal n’est pas essentiel [20, 21], même s’il est impliqué dans la localisation de la protéine p53 sur les fourches de réplication bloquées [19], dans l’interaction avec la protéine de recombinaison Rad54 [22] et dans le métabolisme des intermédiaires de recombinaison [ 24, 25]. Le domaine central et le domaine carboxyterminal de p53 pourraient donc participer à la régulation de la recombinaison homologue par des voies métaboliques parallèles.

Figure 3. Structure de p53 et des protéines de recombinaison homologue Rad51 (humaine) et RecA (bactérienne). A. Domaines fonctionnels de la protéine p53. SLN : signal de localisation nucléaire. B. Domaines fonctionnels de Rad51 et de RecA. Le domaine central, conservé au cours de l’évolution, est appelé « boucle RecA ». Les nombres indiquent la position des résidus d’acides aminés.

Figure 3. Structure de p53 et des protéines de recombinaison homologue Rad51 (humaine) et RecA (bactérienne). A. Domaines fonctionnels de la protéine p53. SLN : signal de localisation nucléaire. B. Domaines fonctionnels de Rad51 et de RecA. Le domaine central, conservé au cours de l’évolution, est appelé « boucle RecA ». Les nombres indiquent la position des résidus d’acides aminés.

Interactions de p53 avec les protéines de recombinaison homologue Rad51 et Rad54

Les régions de p53 qui interagissent avec Rad51 sont localisées aux extrémités du domaine central [ 26] (Figure 3A). C’est aussi dans ce domaine que sont localisés les points chauds de mutation associés aux cancers. Le domaine d’interaction de p53 avec la protéine Rad54 est quant à lui localisé en son extrémité carboxyterminale [22].

Le domaine central de la protéine Rad51 (Figure 3B), qui contient des résidus fixant et hydrolysant l’ATP, est également impliqué dans l’homo-oligomérisation de la protéine, deux activités essentielles pour la recombinaison homologue. L’interaction de Rad51 avec la protéine p53 s’effectue par le biais d’une région comprise entre les deux « boîtes ATP » [26]. Il semble que l’interaction de p53 avec cette région affecte l’activité de Rad51 : ainsi, la répression de la recombinaison homologue par p53 n’est plus observée quand la protéine Rad51 utilisée est le mutant^L186PRad51, incapable d’interagir avec p53 [22]. La protéine Rad51 contrôle le processus de recombinaison homologue en formant des complexes avec de nombreux partenaires, dont les rôles exacts restent à définir. En plus de ses cinq paralogues (Figure 4A), la protéine Rad51 interagit avec de nombreuses autres protéines également impliquées dans le contrôle de la recombinaison homologue, pour lesquelles des interactions physiques avec la protéine p53 ont été décrites (Figure 4B), ce qui suggère que la protéine p53 agit sur le processus de recombinaison homologue par l’intermédiaire d’un ou plusieurs partenaires de Rad51 [ 27].

Figure 4. Complexes protéiques de recombinaison homomogue chez les mammifères. A. Les cinq paralogues (Xrcc2, Xrcc3, Rad51B, Rad51C et Rad51D) de la protéine Rad51 sont impliqués dans deux complexes différents. Aucune interaction physique entre ces paralogues et la protéine p53 n’a clairement été démontrée. B. La protéine Rad51 interagit physiquement avec les autres protéines contrôlant la recombinaison homomogue. Les protéines du complexe capables d’interagir physiquement avec p53 sont cerclées de rouge.

Figure 4. Complexes protéiques de recombinaison homomogue chez les mammifères. A. Les cinq paralogues (Xrcc2, Xrcc3, Rad51B, Rad51C et Rad51D) de la protéine Rad51 sont impliqués dans deux complexes différents. Aucune interaction physique entre ces paralogues et la protéine p53 n’a clairement été démontrée. B. La protéine Rad51 interagit physiquement avec les autres protéines contrôlant la recombinaison homomogue. Les protéines du complexe capables d’interagir physiquement avec p53 sont cerclées de rouge.

En tant que « gardienne du génome », p53 semble particulièrement « prudente », car elle multiplie systématiquement les systèmes de sauvegarde de la stabilité du génome : p53 agit ainsi indirectement, sur le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose via son activité de transactivation, mais aussi directement, en réprimant le mécanisme de recombinaison homologue (→). Ces deux rôles poursuivent le même but, la prévention de l’instabilité génétique, et pourraient donc représenter des systèmes de sauvegarde parallèles. Par ailleurs, p53 utilise deux stratégies complémentaires pour contrôler la recombinaison homologue, chacune impliquant un domaine différent : interaction avec Rad51, à une étape précoce, via son domaine central et, à une étape tardive, interaction avec Rad54 et les intermédiaires de recombinaison homologue via son domaine carboxyterminal.

(→) m/s 2000, n°14, p. 1387

Le système MMR et p53 présentent de nombreuses similitudes. Tous deux protègent l’organisme contre le développement de tumeurs et pourraient agir de façon complémentaire et coordonnée pour empêcher une instabilité génétique liée à un excès de recombinaison homologue [27]. Ces caractéristiques autorisent à s’interroger sur l’implication de l’activité anti-recombinaison homologue de p53 dans les différents processus fondamentaux discutés ci-dessous.