La structure des gènes codant pour les protéines est très différente chez les organismes procaryotes et eucaryotes. Chez les bactéries, les processus moléculaires fondamentaux se déroulent dans un même compartiment et sont le plus souvent simultanés (Figure 2). Les gènes sont constitués d’une seule pièce, et sont fréquemment organisés en opérons (c’est-à-dire en groupes de gènes exprimés simultanément sous le contrôle d’une protéine régulatrice). Les protéines alors produites sont souvent impliquées dans un même processus métabolique, ou peuvent constituer les différentes sous-unités d’une protéine multimérique qui présentera la fonction biologique requise. Chez les organismes eucaryotes, les étapes de transcription et de traduction ne sont que très exceptionnellement simultanées, la transcription se déroulant dans le noyau et la traduction dans le cytoplasme (Figure 3). Par ailleurs, les gènes eucaryotes présentent une structure morcelée : ils sont constitués de régions non codantes parfois très longues, les introns, qui alternent avec des portions effectivement traduites en protéines, les exons.

Figure 2. Structures des gènes chez les organismes procaryotes. Les processus moléculaires associés à la réplication (ADN->ADN), à la transcription (ADN->ARN) et à la traduction (ARN->protéine) se déroulent dans un même compartiment représenté par la cellule de l’organime. Plusieurs signaux permettent la reconnaissance des zones à transcrire, à savoir la région promotrice sur laquelle se fixe l’ARN polymérase pour déclencher la transcription (boîtes -35 et -10) et une région de terminaison (dite indépendante de rho) qui correspond à une structure secondaire en tigeboucle au niveau de laquelle l’ARN polymérase se décroche (Terminateur). Les gènes sont le plus souvent rassemblés en opéron, c’est-à-dire un groupe de gènes exprimés en même temps sous le contrôle d’une protéine régulatrice. Les mécanismes de transcription et de traduction se produisent de façon simultanée : dès que le ribosome peut, au niveau du site RBS (ribosome binding site), se fixer sur la molécule d’ARN messager en cours de fabrication, la traduction de la protéine est mise en route avant même que la transcription soit achevée. Cette traduction débute au niveau du codon d’initiation formé le plus souvent des trois lettres AUG (et plus rarement CUG ou UUG), et se termine par un des trois codons de terminaison universels, UAA, UAG et UGA.

Figure 2. Structures des gènes chez les organismes procaryotes. Les processus moléculaires associés à la réplication (ADN->ADN), à la transcription (ADN->ARN) et à la traduction (ARN->protéine) se déroulent dans un même compartiment représenté par la cellule de l’organime. Plusieurs signaux permettent la reconnaissance des zones à transcrire, à savoir la région promotrice sur laquelle se fixe l’ARN polymérase pour déclencher la transcription (boîtes -35 et -10) et une région de terminaison (dite indépendante de rho) qui correspond à une structure secondaire en tigeboucle au niveau de laquelle l’ARN polymérase se décroche (Terminateur). Les gènes sont le plus souvent rassemblés en opéron, c’est-à-dire un groupe de gènes exprimés en même temps sous le contrôle d’une protéine régulatrice. Les mécanismes de transcription et de traduction se produisent de façon simultanée : dès que le ribosome peut, au niveau du site RBS (ribosome binding site), se fixer sur la molécule d’ARN messager en cours de fabrication, la traduction de la protéine est mise en route avant même que la transcription soit achevée. Cette traduction débute au niveau du codon d’initiation formé le plus souvent des trois lettres AUG (et plus rarement CUG ou UUG), et se termine par un des trois codons de terminaison universels, UAA, UAG et UGA.

L’analyse informatique visant à identifier les gènes d’un organisme combine des méthodes qui permettent d’une part de caractériser les signaux nécessaires à l’expression des gènes (c’est-à-dire des motifs particuliers dans la séquence d’ADN, Figures 2 et 3) et d’autre part, de prédire les régions codantes.

Généralement, le motif consensus est établi à partir d’un ensemble de séquences bien caractérisées dont on sait qu’elles contiennent le signal à caractériser. Celui-ci est appelé jeu ou ensemble d’apprentissage et est généralement construit à partir de résultats expérimentaux. La mise en œuvre de programmes d’alignements multiples sur ce jeu d’apprentissage permet de caractériser des segments de séquences conservés et d’en déduire le (ou les) motifs consensus. Une autre description, plus fine que la précédente, repose sur la notion de «tableau poids-positions». Un tel tableau est constitué de quatre lignes correspondant aux quatres bases (A,C,G et T) et d’autant de colonnes qu’il y a de positions dans le signal que l’on souhaite représenter. L’entrée T(b,i) de ce tableau indique simplement la fréquence relative d’apparition de la base b à la position i du motif, observée sur l’ensemble d’apprentissage [1], c’est-à-dire une mesure de l’importance relative de cette base dans le motif. Lorsque les séquences de l’ensemble d’apprentissage sont suffisamment proches ou lorsque le motif recherché est très conservé, l’alignement ne pose pas de problème et la définition du signal (sous forme de motif consensus ou de tableau poids-positions) est généralement conduite manuellement. Lorsque ces conditions ne sont pas satisfaites, la «découverte» du motif dans l’ensemble d’apprentissage devient plus délicate et nécessite la mise en œuvre d’algorithmes dédiés (on parle alors «d’inférence de motif») [2, 3]. Les étapes de construction de l’ensemble d’apprentissage (rôle du biologiste) et de choix de l’algorithme utilisé pour inférer le consensus (rôle du bioinformaticien), constituent les étapes limitatives du processus de caractérisation de signaux. Rechercher ensuite les occurrences du motif (consensus ou tableau poidsposition) sur une séquence d’ADN ne présente en réalité pas de difficulté majeure. Enfin, il convient de remarquer que d’autres représentations, plus sophistiquées, ont également été proposées, notamment celles fondées sur les «modèles de Markov» (voir glossaire) [4]. D’une manière générale, ces représentations constituent un modèle du signal recherché. Plus ce modèle est sophistiqué (et donc proche de la réalité) plus le nombre de paramètres augmente et plus la question de l’estimation de ces paramètres sur l’ensemble d’apprentissage (de taille nécessairement limité) se pose avec acuité. Enfin, il est important de noter que les signaux dont nous avons parlé jusqu’ici sont essentiellement de nature «lexicale» (seule compte l’identité des bases en chacune des positions). Certains signaux peuvent être de nature plus complexe. Tel est le cas, par exemple, des signaux «structuraux» dans lesquels intervient non pas l’identité des bases mais leur facilité à former une structure secondaire précise (généralement au niveau de l’ARN). Chez les organismes procaryotes, les signaux de terminaison de la transcription (indépendante de rho) en fournissent un exemple. Ce motif étant bien décrit (Figure 2) et conservé entre les espèces procaryotes (eubactéries), l’utilisation du programme Pétrin [5] permet d’obtenir une bonne idée du nombre de séquences transcrites dans une séquence génomique. Chez les organismes eucaryotes, les séquences associées aux différents signaux sont souvent trop courtes et/ou trop peu conservées pour constituer un critère absolu. Les signaux les plus «forts» seraient les sites donneurs et accepteurs du mécanisme d’excision des introns : les introns commencent généralement en 5’ par GT et finissent en 3’ par AG (Figure 3). Cependant, le nombre de mots AG et GT dans une séquence génomique est très important, et la seule présence de ces deux di-nucléotides n’indique donc pas nécessairement la présence d’un intron. On a alors recours à une combinaison de stratégies prenant en compte d’autres séquences plus ou moins conservées voisines des AG et GT, les caractéristiques des exons selon leur position dans le gène, ainsi que d’autres signaux comme les sites de fixation des facteurs de transcription, les îlots CpG situés en amont des gènes, ou encore le site de reconnaissance localisé en aval des gènes, nécessaire à la poly-adénylation de l’ARN messager (Figure 3). De nombreuses méthodes informatiques ont été développées pour rechercher les régions promotrices de la transcription [6], pour identifier spécifiquement les sites d’épissage [7, 8], ou encore les sites d’initiation de la traduction [9]. Elles n’ont donc pas la prétention de déterminer la structure des gènes, mais seulement d’affecter à chaque site potentiel un indice de fiabilité.

Figure 3. Structure des gènes chez les organismes eucaryotes. Si la réplication et la transcription se déroulent dans le noyau de la cellule, la traduction, elle, opère au sein du cytoplasme. L’ARN polymérase utilise des signaux particuliers sur la séquence d’ADN pour déclencher le processus de la transcription qui conduit à la fabrication d’un pré-ARN messager contenant les régions non codantes ou introns, et les régions codantes ou exons. Les introns sont alors excisés avant la traduction grâce à un ensemble moléculaire complexe (le splicéosome) qui reconnaît plusieurs signaux au niveau de la séquence: les sites donneurs et accepteurs à la jonction des exons et des introns, et le site de branchement responsable de la structure en lasso que prend l’intron excisé. Un autre signal primordial chez les eucaryotes est celui qui spécifie le codon d’initiation de la traduction, car il n’y a pas de séquence RBS en amont pour faciliter sa reconnaissance par les ribosomes. Aussi une «coiffe» (ou molécule de guanine monophosphate) est ajoutée à l’extrémité 5’ de la molécule d’ARN messager mûre. Elle protège cette dernière des attaques par les nucléases et permet une meilleure reconnaissance de l’extrémité 5’ par le ribosome. Enfin, la séquence qui pourrait servir de repère de fin de gène à l’ARN polymérase chez les eucaryotes (séquence AATAAA) serait aussi le signal qui commande l’ajout d’une queue de plusieurs dizaines de nucléotides A à l’extrêmité 3’ de l’ARN messager. Cette queue polyA joue un rôle dans la stabilité de l’ARNm, dans son mécanisme de sortie du noyau, et dans la stimulation de l’initiation de la traduction.

Figure 3. Structure des gènes chez les organismes eucaryotes. Si la réplication et la transcription se déroulent dans le noyau de la cellule, la traduction, elle, opère au sein du cytoplasme. L’ARN polymérase utilise des signaux particuliers sur la séquence d’ADN pour déclencher le processus de la transcription qui conduit à la fabrication d’un pré-ARN messager contenant les régions non codantes ou introns, et les régions codantes ou exons. Les introns sont alors excisés avant la traduction grâce à un ensemble moléculaire complexe (le splicéosome) qui reconnaît plusieurs signaux au niveau de la séquence: les sites donneurs et accepteurs à la jonction des exons et des introns, et le site de branchement responsable de la structure en lasso que prend l’intron excisé. Un autre signal primordial chez les eucaryotes est celui qui spécifie le codon d’initiation de la traduction, car il n’y a pas de séquence RBS en amont pour faciliter sa reconnaissance par les ribosomes. Aussi une «coiffe» (ou molécule de guanine monophosphate) est ajoutée à l’extrémité 5’ de la molécule d’ARN messager mûre. Elle protège cette dernière des attaques par les nucléases et permet une meilleure reconnaissance de l’extrémité 5’ par le ribosome. Enfin, la séquence qui pourrait servir de repère de fin de gène à l’ARN polymérase chez les eucaryotes (séquence AATAAA) serait aussi le signal qui commande l’ajout d’une queue de plusieurs dizaines de nucléotides A à l’extrêmité 3’ de l’ARN messager. Cette queue polyA joue un rôle dans la stabilité de l’ARNm, dans son mécanisme de sortie du noyau, et dans la stimulation de l’initiation de la traduction.

Chez les organismes eucaryotes, la situation est plus complexe. Les régions codantes des exons sont parfois trop courtes pour qu’une simple tendance statistique permette de les repérer. Par ailleurs, il n’y a pas de raison pour que leur taille soit un multiple de trois ni qu’elles soient comprises entre deux codons de fin de traduction. La structure fine des gènes, c’est-à-dire leur découpage précis en exons et introns ainsi que leurs extrêmités 5’ et 3’, est prédite par des programmes qui combinent généralement un ensemble de méthodes. Plusieurs mesures sont utilisées pour rendre compte des différences entre les régions codantes et non codantes : des méthodes probabilistes tels que les modèles de Markov déjà mentionnés ci-dessus [12, 13], des méthodes de discrimination tels que les réseaux neuronaux [14] ou les arbres de décision [15]. Ce type de technique a pour objectif de trouver les critères permettant de discriminer deux ensembles de données : les exemples (tels que des séquences correspondant à des sites d’épissage fonctionnels), et les contre-exemples (des séquences qui ressemblent à des sites d’épissage mais qui n’en sont pas). La mise en œuvre de ces techniques va permettre, en général, d’identifier tous les éléments constitutifs des gènes (exons, sites d’épissage, codons initiateurs) individuellement. L’assemblage de ces éléments, pour reconstituer la structure globale d’un gène, est généralement réalisé par d’autres programmes, fondés, par exemple, sur des modèles de Markov à états cachés [16,17]. Outre les approches «intrinsèques» que nous venons de mentionner (c’est-à-dire ne mettant en œuvre que les propriétés statistiques de la séquence d’ADN chromosomique), on peut également recourir, lorsqu’elles sont disponibles, à des informations expérimentales concernant les gènes exprimés dans la cellule. Par exemple, les ADN complémentaires (ADNc) obtenus par transcription inverse de l’ARN messager ne contiennent que les parties exoniques d’un gène. Une autre source essentielle d’information se trouve dans les EST (expressed sequence tags), obtenus par séquençage systématique des extrémités d’ADNc. La mise en œuvre de programmes de recherche de similarité, à partir de banques d’ADNc [18] ou d’EST [19], permet alors de mettre en évidence des régions de la séquence génomique analysée contenant des exons, et par là même les frontières intron-exon deviennent plus aisées à identifier. La nature de cette similarité pose cependant des problèmes car les séquences d’EST sont non seulement très courtes, mais aussi parfois, de plus mauvaise qualité que l’ADN génomique. Une autre solution consiste alors à comparer les six séquences peptidiques, obtenues après traduction de la séquence génomique sur les six cadres de lecture possibles, aux protéines répertoriées dans une banque de protéines connues telle que SwissProt [20]. Un des atouts de cette approche réside dans le fait que la comparaison entre protéines a toute les chances d’être plus sensible que la comparaison ADN/ADN. Les séquences protéiques sont en effet mieux conservées (dégénérescence du code génétique), et la taille plus importante de leur alphabet rend les identités fortuites moins probables. Néanmoins, les méthodes qui reposent sur ce type de comparaisons ne seront fructueuses qu’à la condition évidente qu’au moins une séquence suffisamment proche soit présente dans les banques.

Le cas des organismes eucaryotes est, en revanche, beaucoup plus délicat. L’évaluation des différents programmes de prédiction de gènes eucaryotes a révélé que, si plus de 90 % des nucléotides sont correctement identifiés comme étant codant ou non codant, la détermination exacte des bornes des exons et leur assemblage en une séquence codante complète et correcte est une toute autre affaire [24, 25]. Un premier problème auquel sont confrontées toutes les méthodes de prédiction est l’extrême diversité de la structure des gènes des organismes eucaryotes : en effet, si la taille moyenne d’un gène chez l’homme est de 27 kb (régions introniques incluses) [26], le gène de la dystrophine par exemple, mesure plus de 2 millions de nucléotides dont 99 % sont des introns de taille parfois supérieure à 100 kb. On comprend aisément que, dans cette situation, les programmes aient tendance à prédire plusieurs gènes au lieu d’un seul. À l’inverse, deux gènes peuvent être vus comme un seul, notamment lorsque la séquence inter-génique qui les sépare est courte voire inexistante, ou dans le cas de gènes se recouvrant. Par ailleurs, à chaque étape de la synthèse des protéines sont associées des possibilités alternatives pouvant conduire à la synthèse d’une protéine différente : promoteur alternatif, épissage alternatif, polyadénylation alternative et initiation alternative de la traduction. Les programmes de prédiction ne savent pas gérer ces différents cas et ne prédisent généralement qu’une seule structure «optimale» de gène. Enfin, d’autres cas particuliers, peu ou pas pris en compte dans les stratégies de recherche de gènes eucaryotes, sont les sites d’épissage non-standards (ne présentant pas le dinucléotide consensus GT ou AG) ou encore les cas dans lesquels la traduction ne débute pas sur un codon AUG. Ces exemples montrent à quel point la coordination de nombreux mécanismes biologiques est encore mal comprise.

Le problème de la détection des gènes eucaryotes est donc encore loin d’être résolu, bien que l’on sache qu’il doit exister une solution : la cellule, elle, ne se trompe pas et réalise l’épissage des exons avec une grande efficacité et une grande précision. Un des problèmes majeurs de l’annotation in silico consiste à élaborer des prédictions à partir de données de séquences analysées sous une forme linéaire et « statique », alors que dans la cellule, cette même séquence présente des conformations bien plus complexes (secondaires et tertiaires), et se trouve placée dans un milieu «dynamique».

L’architecture modulaire de nombreuses protéines (c’est-à-dire composée en domaines protéiques) rend nécessaire le recours aux banques de motifs. Plusieurs banques de ce type ont été constituées. La plus ancienne, PROSITE [28], recense les motifs consensus caractéristiques de familles de protéines ayant une activité biologique voisine. Les domaines protéiques sont généralement répertoriés sous la forme de séquences consensus ou de tableaux poids-positions (comme cela a été décrit précédemment pour les motifs nucléiques). L’une des banques les plus utilisée à ce jour est PFAM, fondée sur la comparaison systématique de toutes les séquences protéiques de la banque SwissProt [29]. Il existe presque autant de programmes de recherche de domaines protéiques sur une séquence qu’il y a de banques de motifs différentes. Un effort de «standardisation» a été récemment entrepris pour définir les formats de ces banques et les «styles» d’annotation destinés à décrire les fonctions biologiques [30]. L’approche par motifs ne garantit, toutefois, pas plus que la comparaison de séquences deux à deux de l’effet de propagation des erreurs précédemment évoquée. En effet, de nombreuses protéines sont formées par l’assemblage de plusieurs domaines, plus ou moins conservés ou bien même remaniés dans d’autres protéines non apparentées. Ces mécanismes évolutifs sont à la source même de prédictions erronées, et les banques de motifs protéiques sont, dans ce sens, à utiliser également avec la plus grande prudence.

Finalement, connaître la succession des acides aminés d’une séquence protéique (sa structure primaire) ne suffit pas pour comprendre pleinement son rôle biologique et ses interactions avec d’autres protéines ou avec ses substrats. Ces chaînes se replient sur elles-mêmes et adoptent des conformations secondaires puis tertiaires qui confèrent à la protéine ses propriétés. Si les méthodes de détection de régions transmembranaires, de peptides signaux, et de structures secondaires conduisent à des résultats généralement satisfaisants [24], prédire la structure tertiaire d’une protéine reste une entreprise beaucoup plus ardue. ll existe une banque de données très précieuse, la Protein Data Bank [31], répertoriant les coordonnées atomiques de plus de 1 500 protéines de séquences significativement différentes. Cet échantillon permet de mettre en œuvre des méthodes de modélisation moléculaire qui ont pour objectif de construire un modèle structural en comparant la séquence de la molécule étudiée avec celle des protéines de conformation 3D connue. Cette dernière approche reste délicate car, sauf cas particulier (par exemple les protéines membranaires), la liaison entre les classes de repliements et la fonction de la protéine n’est pas toujours évidente.

Un voisinage naturel est la proximité sur le chromosome. Chez les organismes procaryotes, il existe une structure de contrôle coordonnée, l’opéron, qui montre que des gènes situés à proximité les uns des autres peuvent être reliés fonctionnellement (Tableau I). Plusieurs bases de données contiennent des informations structurales sur la régulation de l’expression génique, signalant par exemple l’existence d’un site de fixation d’un facteur de transcription dans la région promotrice d’un gène, ou définissant un domaine polypeptidique impliqué dans les interactions protéines-protéines ou protéines-ADN [33, 34]. Il existe toutefois de nombreuses unités de transcription qui ne comprennent qu’un seul gène, et les organismes eucaryotes n’organisent généralement pas la transcription de leurs gènes sous la forme d’opérons. L’analyse de la ressemblance entre les gènes ou plus souvent, les produits des gènes, permet d’explorer un autre type de voisinage. La création de familles de paralogues ou de familles d’orthologues (voir glossaire) constitue des exemples d’exploration de l’espace de similarité en séquence entre les protéines. Les bases de données COG [35], WIT [36], ColiPage [37], ou encore HOBACGEN [38] ont pour objectif de décrire de telles familles. Cette étape est un point de départ vers la carac-térisation de groupes de synténie conservés entre plusieurs génomes, c’est-à-dire des ensembles de gènes dont les positions respectives ont été conservées au cours de l’évolution (voir glossaire) (Figure 4). Il est en effet remarquable de constater que, dans de nombreux génomes procaryotes, il existe une corrélation très forte entre cette organisation synténique et l’interaction physique entre les produits des gènes voisins [39]. Les groupes de synténie sont définis selon des critères plus ou moins stricts, liés à la similitude des séquences, la conservation de l’ordre des gènes sur le chromosome, la distance respective des gènes les uns par rapport aux autres, etc (Figure 4). Plusieurs approches ont été développées, parmi lesquelles WIT [36] et STRING [40], mais les correspondances multiples entre gènes ne sont pas toujours correctement prises en compte. D’un point de vue fonctionnel, des enzymes peuvent être voisines parce qu’elles utilisent le même substrat, produisent le même produit, ou encore se succèdent dans une même voie métabolique. L’exploitation de données métaboliques de référence [41, 42] constitue alors un outil puissant non seulement parce qu’elle permet de renforcer les résultats de l’analyse de similarité, mais aussi parce qu’elle autorise la découverte de fonctions ou voies métaboliques alternatives (Figure 5). Il existe, enfin, des voisinages plus complexes qui produisent des résultats parfois particulièrement riches. Les gènes sont en effet liés par leur façon «d’utiliser» le code génétique. Les codons synonymes (par exemple, les 4 codons CGU, CGC, CGA et CGG correspondent à l’acide aminé arginine) ne sont pas utilisés avec la même fréquence, et cette utilisation différentielle des codons (ou biais de codage) est caractéristique de chaque espèce. Ainsi, la connaissance du biais de codage de gènes déjà identifiés chez l’organisme étudié va-t-elle permettre de mieux prédire de nouveaux gènes du même organisme.

Figure 4. Intérêts de l’analyse des groupes de synténie bactérienne. Des similarités significatives (ou parentés) entre gènes, au sein d’une même espèce ou entre plusieurs espèces, vont permettent d’inférer certaines propriétés aux protéines codées. Ainsi, la comparaison du génome III aux génomes I et II révèle que le premier ensemble constitué de cinq gènes contigus contient 4 gènes dont les orthologues ont une même organisation locale dans le génome II, et une organisation proche dans le génome I. On peut envisager que cet ensemble de gènes représente une famille de gènes universelle et que le gène situé au centre de cette famille (en blanc) a probablement une fonction proche du gène rouge situé au même endroit dans le génome II. Ce type d’analyse permet aussi d’identifier des mécanismes évolutifs résultant de la fusion/fission de gènes ainsi que des opérons conservés entre différentes espèces.

Figure 4. Intérêts de l’analyse des groupes de synténie bactérienne. Des similarités significatives (ou parentés) entre gènes, au sein d’une même espèce ou entre plusieurs espèces, vont permettent d’inférer certaines propriétés aux protéines codées. Ainsi, la comparaison du génome III aux génomes I et II révèle que le premier ensemble constitué de cinq gènes contigus contient 4 gènes dont les orthologues ont une même organisation locale dans le génome II, et une organisation proche dans le génome I. On peut envisager que cet ensemble de gènes représente une famille de gènes universelle et que le gène situé au centre de cette famille (en blanc) a probablement une fonction proche du gène rouge situé au même endroit dans le génome II. Ce type d’analyse permet aussi d’identifier des mécanismes évolutifs résultant de la fusion/fission de gènes ainsi que des opérons conservés entre différentes espèces.

Figure 5. Reconstitution de voies métaboliques. L’ensemble des enzymes caractérisées au cours de la première étape d’annotation autorise une première reconstitution des voies métaboliques de l’organisme étudié (B), le plus souvent par référence aux voies métaboliques d’un organisme (A) proche et bien étudié. Ainsi, dans cet exemple, aucun gène homologue à ceux qui codent pour les enzymes E2 et E5 ne sont retrouvés dans le génome de l’organisme B. Dans l’hypothèse où l’annotation de premier niveau est correcte et exhaustive, cette observation suggère que les enzymes E2 et E5 n’existent pas chez l’organisme B qui utilise alors des voies métaboliques alternatives à découvrir.

Figure 5. Reconstitution de voies métaboliques. L’ensemble des enzymes caractérisées au cours de la première étape d’annotation autorise une première reconstitution des voies métaboliques de l’organisme étudié (B), le plus souvent par référence aux voies métaboliques d’un organisme (A) proche et bien étudié. Ainsi, dans cet exemple, aucun gène homologue à ceux qui codent pour les enzymes E2 et E5 ne sont retrouvés dans le génome de l’organisme B. Dans l’hypothèse où l’annotation de premier niveau est correcte et exhaustive, cette observation suggère que les enzymes E2 et E5 n’existent pas chez l’organisme B qui utilise alors des voies métaboliques alternatives à découvrir.

Idéalement, l’analyse de ces relations et voisinages devrait faire partie du processus complet d’annotation. Cependant, une telle exploration nécessite d’autres études expérimentales et informatiques, et les outils qui apparaissent tout juste dans ce domaine (qu’il s’agisse de méthodes informatiques ou de bases de données spécialisées) sont actuellement encore très dispersés dans les différents laboratoires.